Hyun-Ji Bock et al., |
要約 |
| 私たちは、Lactiplantibacillus plantarum KU210152 のプロバイオティクス特性と神経保護効果、および豆乳への応用を評価しました。 L. plantarum KU210152 は、人工胃腸条件に対する高い耐性、腸細胞 (HT-29) への高い接着性、および安全な酵素生成を示しました。 熱殺菌乳酸菌 (LAB-CM) で処理した腸細胞(HT-29)から取得した馴化培地を使用して、神経保護効果を評価しました。 熱殺菌乳酸菌は、細胞生存率アッセイ、形態学的観察、および 活性酸素種（ROS） 産生の抑制を通じて神経保護効果を示しました。 熱で死滅させたL. plantarum KU210152は、腸細胞(HT-29)における脳由来神経栄養因子（BDNF）およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）の発現を増加させた。 ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞では、熱殺菌L. plantarum KU210152 (CM) で前処理すると、Bax/Bcl-2 比（訳者注：アポトーシスの調節因子、アポトーシスに促進的なBax／アポトーシス阻害的なBcl-2）が減少し、脳由来神経栄養因子とチロシンヒドロキシラーゼの発現が上方制御されました。 熱殺菌乳酸菌はカスパーゼ 9 およびカスパーゼ 3 の活性を阻害しました。 L. plantarum KU210152 の神経保護効果は発酵豆乳でも確認されました。 したがって、L. plantarum KU210152と豆乳発酵液はいずれも、酸化ストレスに対する神経保護作用を有する機能性素材として利用できる。 |
| 概念図 |
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| 目次（クリックして記事にアクセスできます） |
| 2.材料と方法 |
| 2.1. 菌株と培養条件 |
| 2.2. 細胞培養条件 |
| 2.3. 人工胃液および胆汁酸塩に対する耐性 |
| 2.4. 腸細胞への接着能 |
| 2.5. 酵素の生産 |
| 2.6. 加熱死滅させた乳酸菌馴化培地の調製 |
| 2.7. 発酵豆乳の調製 |
| 2.8. 生存乳酸菌数、pH、および滴定酸度 |
| 2.9. 豆乳発酵上清の調製 |
| 2.10. 過酸化水素誘発ヒト神経芽腫細胞に対する熱殺菌乳酸菌または発酵豆乳上清の影響 |
| 2.11. 活性酸素種の生成 |
| 2.12. リアルタイム PCRを使用した相対的遺伝子発現解析 |
| 2.13. カスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 活性 |
| 2.14. 統計分析 |
| 3.結果と考察 |
| 3.1. 模擬胃腸状態に対するプロバイオティクス株の耐性および腸細胞への接着能力 |
| 3.2. 酵素の生産 |
| 3.3. 過酸化水素誘発ヒト神経芽腫細胞に対する熱殺菌乳酸菌の効果 |
| 3.4. ヒト神経芽腫細胞の形態変化と活性酸素種産生に対する熱殺菌乳酸菌の影響 |
| 3.5. 相対的な遺伝子発現に対する加熱死滅乳酸菌および熱殺菌乳酸菌の影響 |
| 3.6. カスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 活性に対する 熱殺菌乳酸菌の影響 |
| 3.7. 豆乳発酵中および冷蔵保存中のpH、滴定酸度、生存乳酸菌の変化 |
| 3.8. ヒト神経芽腫細胞に対する豆乳発酵液の影響 |
| 3.9. ヒト神経芽腫細胞の形態変化と活性酸素種産生に対する発酵豆乳の影響 |
| 4. 結論 |
| 本文 |
| 1. はじめに |
| アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患には、神経系の継続的かつ不可逆的な悪化が伴います。 活性酸素種 (ROS) レベルと抗酸化防御システムの反応の間の不均衡は、酸化ストレスを引き起こします (Dasuri et al., 2013)。 活性酸素種 (ROS)によって引き起こされる蓄積酸化ストレスはアポトーシスに関連しており、神経変性疾患の発症において重要な役割を果たしています (Patten et al., 2010)。 過酸化水素 (H2O2) は、分子状酸素を使用する正常および/または異常な代謝プロセスの副産物です。 過酸化水素 (H2O2)はミトコンドリアの機能不全、脂質過酸化、DNA 損傷を引き起こし、神経細胞のアポトーシスを誘導します (Nissanka & Moraes、2018)。 |
| 腸-脳軸 (GBA) は、胃腸管と脳の間の双方向のシグナル伝達経路です (Cryan & O'Mahony、2011)。 宿主と腸内微生物叢の間の相乗効果は、腸-脳軸 (GBA)を介して宿主の脳と行動を調節します。 さらに、腸-脳軸 (GBA)は精神的健康および認知機能に関連する疾患の潜在的な治療標的です (Cryan et al., 2019)。 腸-脳軸 (GBA)に関するこれまでの研究に基づくと、腸内微生物叢は、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗生物質の投与、および糞便微生物叢の移植によって改変することができる(Yeo、2023)。 これらのアプローチは、微生物叢を修正する能力を通じて精神的健康を強化することが示唆されています（Morkl et al.,2020）。 いくつかの研究では、プロバイオティクス株が神経疾患の治療に有益であることが報告されている（Ishii et al., 2021; Sharma et al., 2023）。 |
| プロバイオティクスは、「適切な量で投与された場合に宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義されています。 いくつかの研究では、プロバイオティクスには抗菌、免疫調節、抗酸化、抗がん特性などのいくつかの有益な特性があることが報告されています（De Marco et al., 2018; Oh et al., 2018）。 プロバイオティクスは、神経障害を悪化させる酸化ストレス、神経伝達物質レベルの低下、慢性炎症などのいくつかの有害な生理学的プロセスから宿主を防御します（Westfall et al.、2017）。 さらに、プロバイオティクスは、うつ病様行動の軽減や不安の正常化など、脳機能に有益な調節効果をもたらします（Gazerani、2019）。 |
| プロバイオティクス細菌はさまざまな発酵食品に存在し、乳製品はプロバイオティクスの主な担体です (Pramanik et al., 2023)。 しかし、ベジタリアン代替品の需要、アレルギー誘発性、乳糖不耐症などの理由から、牛乳の代替品が研究されています。 いくつかの代替品の中でも、豆乳はプロバイオティクス株の優れた基質です (Farnworth et al., 2007)。 大豆製品、特に豆乳ヨーグルトは、プロバイオティクスの潜在的な媒体として機能し、宿主に健康上の利点をもたらす可能性があります (Valero-Cases et al.,2020)。 |
| 表 1 この研究で使用した乳酸菌のプロバイオティクス特性 |
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データは、３回の実験の平均±標準偏差として示される。 同じ実験における異なる株について、異なる上付き文字 (a、b) を持つ平均値は有意に異なりました (P < 0.05、スチューデントの t 検定)。 LGG:Lacticaseibacillus rhamnosus GG、 L. plantarum：Lactiplantibacillus plantarum。 |
| 豆乳にはイソフラボンなどの生理活性物質が含まれています。 サポニンを含み、乳糖とコレステロールを含みません（Rui et al., 2019）。 大豆に含まれるイソフラボンは、骨粗鬆症、更年期障害、心血管疾患、がんの治療における有益な効果について研究されています (Omoni & Aluko、2005)。 乳酸菌（LAB）は、イソフラボンのグルコシド型をイソフラボン アグリコンに発酵させます。 これらの大豆イソフラボン アグリコンは、グルコシド型よりも容易に吸収されます (Choi et al., 2022)。 |
| 本研究では、Lactiplantibacillus plantarum KU210152 のプロバイオティクス特性と神経保護効果を調査しました。 菌株のプロバイオティクスの性質は、人工的な消化条件に対する耐性、腸管接着能力、および酵素生成を調査することによって評価されました。 神経保護効果は、神経バイオマーカーとアポトーシス因子のレベルを測定することによって評価されました。 さらに、プロバイオティクス菌株 L. plantarum KU210152 を発酵豆乳に添加し、処理した発酵豆乳の神経保護効果を評価しました。 |
| 2.材料と方法 |
| 2.1. 菌株と培養条件 |
| Lactiplantibacillus plantarum KU210152 はキムチサンプルから分離されました。 Streptococcus thermophilus P206 は、ABT-B 市販ヨーグルトスターター培養物から分離されました。 Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) は、韓国型培養コレクション (KCTC、Daejeon, Korea) から入手し、参照株として使用しました。 L. plantarum KU210152 およびLacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG)を、de Man、Rogosa、および Sharpe ブロス (MRS; Difco Laboratories、Detroit, MI, USA) 中で 37 °C で 24 時間培養しました。 Streptococcus thermophilus P206 は市販のヨーグルトから分離され、この菌株は MRS ブロス中で 37 °C で 18 時間培養されました。 |
| 細菌サンプルは、14,240 × g、4 °C で 5 分間遠心分離して調製されました。 ペレットを3回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS; HyClone Laboratories、Logan, UT, USA)に再懸濁した(Cheon et al., 2020)。 熱死菌体は、細菌細胞をウォーターバス中で 80 °C で 30 分間加熱することによって調製され、プレート計数法によって死滅した細胞を確認しました。 |
| 2.2. 細胞培養条件 |
| HT-29 (ヒト結腸腺がん; KCLB 30038) 細胞は、Roswell Park Memorial Institute (RPMI; HyClone) 1640 培地で培養されました。 SH-SY5Y (ヒト神経芽腫; ATCC CRL-2266) 細胞をダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; HyClone) で培養しました。 各培地には、10% ウシ胎児生理食塩水 (FBS; HyClone) および 1% ペニシリン (HyClone) 溶液が含まれていました。 細胞は 5 % CO2 環境で 37 °C でインキュベートされました。 |
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図 1. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する乳酸菌馴化培地 (CM) の神経保護効果。 (A) ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する乳酸菌馴化培地 (CM)の効果。 (B) ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する 過酸化水素（H2O2 ）の影響。 (C) 過酸化水素（H2O2 ）処理ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する乳酸菌馴化培地 (LAB CM)の効果。 LGG：加熱死滅させたLacticaseibacillus rhamnosus GGの馴化培地（CM）。 KU210152：加熱殺菌Lactiplantibacillus plantarum KU210152の馴化培地（CM）。 データは、3回の実験の平均±標準偏差として表示されます。 エラーバー上の異なる文字は、有意な差を示します (P < 0.05)。 |
| 2.3. 人工胃液および胆汁酸塩に対する耐性 |
| 胃腸の状態に対する細菌株の耐性は、Song et al (2020) の記載に従って、若干の修正を加えて評価されました。人工胃腸の状態はそれぞれ、以下を使用してシミュレートされました。 1) 0.3 % ペプシンを含む MRS ブロス (pH 2.5) (Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA) (w/v)および２）０．３％豚胆汁抽出物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｗ／ｖ）を含有するＭＲＳブロス。 前培養した 乳酸菌株 (1 × 108 コロニー形成単位 (CFU)/mL) を各タイプの MRS ブロスに接種し、37 °C で 3 時間および 24 時間インキュベートしました。 細菌株の生存率は、次の方程式を使用して決定されました。 生存率 (%) == Nt ／Ni × 100 ここで、Nt と Ni は、それぞれ処理後の生存細菌細胞数 (log CFU/mL) と初期細胞数 (log CFU/mL) を示します。 |
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図 2. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する乳酸菌馴化培地 (CM) の効果。 (A) 形態学的変化。 (B) 活性酸素種 (ROS) の生成。 LGG：加熱死滅させたLacticaseibacillus rhamnosus GGの馴化培地 (CM)。 KU210152：加熱殺菌Lactiplantibacillus plantarum KU210152の馴化培地 (CM)。 白と黒のスケール バーは倍率 40 倍で 100 μm を示します。 グラフは活性酸素種（ROS）の蛍光強度をimageJを用いて表したものです。 データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 |
| 2.4. 腸細胞 (HT-29)への接着能 |
| 乳酸菌株の接着能力は、Son et al. (2018) に記載されているように、いくつかの修正を加えて腸細胞を使用して評価されました。 腸細胞（HT-29）を 24 ウェルプレート (1 × 105 細胞/mL) に播種し、24 時間インキュベートしました。 次に、培地を抗生物質を含まない培地に交換し、1 × 108 CFU/mL 乳酸菌を細胞に添加しました。 2時間のインキュベーション後、非付着細菌細胞をPBSで3回洗浄し、1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)を使用して付着細胞を腸細胞（HT-29）から剥離した。 MRS寒天培地上で細菌を計数し、次の式を使用して付着能力を測定しました。
接着力（％）＝ Na ／Ni × 100 ここで、Na および Ni は、それぞれ付着細菌細胞数 (CFU/mL) および初期細胞数 (CFU/mL) を示します。 |
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図 3. HT-29 細胞および SH-SY5Y 細胞における神経バイオマーカーおよびアポトーシス関連遺伝子の mRNA 発現。 (A) HT-29 細胞における BDNF および TH の発現。 (B) SH-SY5Y 細胞における Bax/Bcl-2 比。 (C) SH-SY5Y 細胞における BDNF および TH の発現。 LGG:加熱死滅させたLacticaseibacillus rhamnosus GG（LGG）の馴化培地（CM）。 KU210152:加熱殺菌Lactiplantibacillus plantarum KU210152のCM。 データは、3回の実験の平均±標準偏差として表示されます。 エラーバー上の異なる文字は、有意な差異を示します (P < 0.05)。 BDNF:脳由来神経栄養因子。 TH:チロシンヒドロキシラーゼ。 Bax:Bcl-2 関連 X タンパク質。 Bcl-2:B細胞リンパ腫2。 |
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図 4. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞におけるカスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 の活性に対する乳酸菌馴化培地 (CM) の効果。 (A) カスパーゼ-9 活性、および (B) カスパーゼ-3 活性。 LGG：加熱死滅させたLacticaseibacillus rhamnosus GGの馴化培地（CM）。 KU210152：加熱殺菌Lactiplantibacillus plantarum KU210152の馴化培地（CM）。 データは、3回の実験の平均±標準偏差として表示されます。 エラーバー上の異なる文字は、有意な差を示します (P < 0.05)。 |
| 2.5. 酵素の生産 |
| 乳酸菌株による酵素生産は、API ZYM キット (bioM´erieux、Marcy-l''Etoile、France) を使用して評価されました。 生細菌細胞 (65 μL) をコップルに加え、37 °C で 4 時間インキュベートしました。 ZYM A 試薬および ZYM B 試薬と 5 分間インキュベートした後、色の強度に基づいて酵素生成を推定しました。 |
| 2.6. 加熱死滅させた乳酸菌馴化培地(CM)の調製 |
| 神経保護効果を調査するために、Cheon et al (2020) の方法に従って馴化培地(CM)が作成されました。 腸細胞（HT-29）を 6 ウェルプレート (5 × 105 細胞/mL) に播種し、単層が形成されるまでインキュベートしました。： 熱不活化 乳酸菌(1 × 109 CFU/mL) を単層に添加して 乳酸菌馴化培地(CM)を調製し、コントロール馴化培地(CM)は細胞を PBS で処理することによって調製しました。 腸細胞（HT-29）を 24 時間処理した後、14,000 × g、4 ℃で 10 分間遠心分離して上清を収集しました。 次に、上清を0.45μmフィルターで濾過した。 コントロールと乳酸菌馴化培地(CM)は両方とも、さらなる実験のために –80 °C で保存されました。 |
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図 5. 発酵中（A ～ C）および冷蔵保存中（D ～ F）における発酵豆乳サンプルの pH、滴定酸度（TA）、生菌数の変化。 CY：Streptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 GY：Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) と S. Thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 PY：Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. Thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 |
| 2.7. 発酵豆乳の調製 |
| 豆乳 (Maeil Dairies Co.、Seoul, Korea) は 90 °C で滅菌されました。 10分間放置し、42℃まで冷却しました。 次に、滅菌豆乳を 3 等分し、前培養した S. Thermophilus P206 懸濁液 1 % (v/v) を各サンプルに添加しました。 発酵豆乳サンプルの調製では、3 つのサンプルのうち 2 つに 1 % (v/v) L. rhamnosus GG (LGG)および L. plantarum KU210152 培養物を (別々に) 植菌し、3 つの豆乳サンプルを 42 °C で pH4.5に達するまで発酵させました。 酸性化後の生細胞数を測定するために、発酵豆乳サンプルを 4 °C の冷蔵庫で 21 日間保管しました。 3 つの異なる発酵豆乳サンプルを調製し、次のようにラベルを付けました。
CY：Streptococcus thermophilus P206で発酵させた対照発酵豆乳。 GY：Streptococcus thermophilus P206およびLacticaseibacillus rhamnosus GGを含む発酵豆乳。 PY：Streptococcus thermophilus P206および Lactiplantibacillus plantarum KU210152 を含む発酵豆乳。 |
| 2.8. 生存乳酸菌数、pH、および滴定酸度 (TA) |
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Song et al.(2021)によって記載されているように、豆乳発酵中および21日間の保存後にMRS寒天プレート上のコロニーの数を計数することによって生細胞数を測定した。 ｐＨは、ｐＨメーター（ＷＴＷ、ヴァイハイム、ドイツ）を使用して測定した。 発酵豆乳サンプルの滴定酸度（TA ）を測定するには、各サンプル 10 g を蒸留水 10 mL と混合し、pH が 8.3 に上昇するまで 0.1 N NaOH で滴定しました。 TA は次の式を使用して計算されました。 TA (%) =N／S ×0.009×100 ここで、N、S、0.009は、それぞれ0.1N NaOH添加量(mL)、試料重量(g)、乳酸換算係数を示します。 |
| 2.9. 豆乳発酵上清の調製 |
| 発酵豆乳の上清は、Song et al (2021) に記載の方法に若干の変更を加えて調製しました。 発酵豆乳のサンプル (10 g) を滅菌蒸留水 (2.5 mL) と混合し、均質化しました。 混合物を 4 ℃、14,240 × g で 5 分間遠心分離しました。 １Ｍ ＮａＯＨを使用して上清のｐＨを７．０に調整し、上記と同じ条件下で遠心分離した。 採取した上清を0.45μmのフィルターでろ過し、豆乳発酵上清を－20℃で保存しました。 |
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図 6. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する発酵豆乳サンプルの神経保護効果。 (A) ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する発酵豆乳の影響。 (B) ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する 過酸化水素（H2O2 ）の影響。 (C) 過酸化水素（H2O2 ）誘発性ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する発酵豆乳サンプルの影響。 CY：Streptococcus thermophilus P206で発酵させた豆乳。 GY：Lacticaseibacillus rhamnosus GGと S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 PY：Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 データは、3回の実験の平均±標準偏差として表示されます。 エラーバー上の異なる文字は、有意な差を示します (P < 0.05)。 |
| 2.10. 過酸化水素（H2O2 ）誘発ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する乳酸菌馴化培地 (LAB CM)または発酵豆乳上清の影響 |
| Cheon et al (2020) の方法に従って、乳酸菌馴化培地 (LAB CM)または発酵豆乳上清の効果を評価するために MTT アッセイを実施しました。 ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞を 96 ウェルプレートに播種しました (1 × 106 細胞/ mL）を加えて24時間インキュベートしました。 乳酸菌馴化培地 (LAB CM)または発酵豆乳上清で 4 時間前処理した後、細胞を過酸化水素（H2O2 ）で 20 時間インキュベートしました。 媒体を廃棄し、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)溶液(5mg/mL)を加えた。 次に、反応したMTT溶液を除去し、ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えた。 溶液の吸光度を570nmで測定した。 細胞生存率は次の方程式を使用して決定されました。
細胞生存率 (%) =Aｓ／Ａc×100 ここで、As および Ac は、それぞれサンプルおよびコントロールで処理された細胞の吸光度を表します。 |
| 乳酸菌馴化培地 (LAB CM)または発酵豆乳上清の効果は、ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の形態学的変化を観察することによっても評価されました。 細胞を上記と同じ条件下で乳酸菌馴化培地 (LAB CM)または発酵豆乳上清および過酸化水素（H2O2 ）で処理し、Nikon Eclipse Ti2-U蛍光顕微鏡（Nikon Co., Ltd., Tokyo, Japan）およびDS-Ri2デジタルカメラ（Nikon Co., Ltd.,）を使用して観察しました。 |
| 2.11. 活性酸素種（ROS）の生成 |
| ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞を 12 ウェルプレート (1 × 106 細胞/mL) に播種し、発酵豆乳上清で 4 時間、過酸化水素（H2O2 ）で 20 時間処理しました。 細胞をＰＢＳで洗浄し、２'，７'－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。 37℃で30分間インキュベートした後、細胞を再度PBSで洗浄し、Nikon Eclipse Ti2-U蛍光顕微鏡（株式会社ニコン）を使用して観察しました。 画像は DS-Ri2 デジタル カメラ (Nikon Co., Ltd.,) を使用して撮影されました。 この画像は、ImageJ ソフトウェア (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) を使用して分析されました。 |
| 2.12. リアルタイム PCR (RT-PCR) を使用した相対的遺伝子発現解析 |
| アポトーシス関連遺伝子および神経バイオマーカーの発現を決定するために、腸細胞（HT-29）および ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞から抽出した RNA を使用してリアルタイム PCR (RT-PCR)を実行しました。 腸細胞（HT-29）を 6 ウェルプレート (5 × 105 細胞/mL) で単層が形成されるまでインキュベートし、熱殺菌した 乳酸菌で 24 時間処理しました。 ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞を 6 ウェルプレート (1 × 106 細胞/mL) に播種し、サンプルで処理しました。 4 時間後、細胞を 過酸化水素（H2O2 ）で 3 時間処理しました。 RNeasy® Mini キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して全 RNA を抽出し、cDNA 合成キット (Thermo-Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して単離された RNA を cDNA に逆転写しました。 アポトーシス関連遺伝子 (Bcl-2 関連 X タンパク質、Bax、B 細胞リンパ腫 2、Bcl-2) および神経バイオマーカー (脳由来神経栄養因子：BDNF、チロシンヒドロキシラーゼ：TH) の発現をSYBR Green PCR マスターミックスを使用してリアルタイム PCR (RT-PCR)によって評価しました。 ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を使用し、2-ΔΔCt法を用いて遺伝子発現を解析した。 プライマー配列を表 S1 に示します (Bock et al., 2023)。 |
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図 7. リアルタイム PCR (RT-PCR)に対する発酵豆乳サンプルの効果。 (A) 形態学的変化。 (B) 活性酸素種 (ROS) の生成。 CY：Streptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 GY：Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 PY：Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳。 白と黒のスケール バーは倍率 40 倍で 100 μm を示します。 グラフはROSの蛍光強度をimageJを用いて表したものです。 データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 |
| 2.13. カスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 活性 |
| ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞におけるカスパーゼ-9およびカスパーゼ-3の活性は、それぞれカスパーゼ-9アッセイキット（比色分析）およびカスパーゼ-3アッセイキット（比色分析）（Abcam、Cambridge, UK,）を使用して測定した。 細胞を 6 ウェルプレート (1 × 106 細胞/mL) に播種し、サンプルで 4 時間、H2O2 で 6 時間処理しました。 メーカーの説明書に従って、100μgのタンパク質を含む細胞溶解物を、10mM DTT（ジチオスレイトール）を含む50μLの2×反応バッファーと等量混合しました。 次に、カスパーゼ-9活性を評価するために5μLのLEHD-ρ-NA基質(4mM)を添加し、カスパーゼ-3活性を評価するために5μLのDEVD-ρ-NA基質(4mM)を添加した。 37 °C で 2 時間インキュベートした後、400 nm で吸光度を測定しました。 |
| 2.14. 統計分析 |
| すべての実験結果は 3 回取得され、平均 ± 標準偏差として表示されます。 ダンカンの複数範囲検定とスチューデントの t 検定を使用した一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して、有意差を検証しました。 値は P < 0.05 で有意であるとみなされ、すべてのデータは SPSS (IBM、ニューヨーク州アーモンク、米国) を使用して分析されました。 |
| 3.結果と考察 |
| 3.1. 模擬胃腸状態に対するプロバイオティクス株の耐性および腸細胞（HT-29）への接着能力 |
| プロバイオティクスとして応用するには、乳酸菌株は胃酸と胆汁酸塩に耐性がある必要があります (Son et al., 2018)。 表 1 は、乳酸菌株の胃酸および胆汁酸塩耐性能力を示しています。 酸性胃条件下では、Lacticaseibacillus rhamnosus GG細胞とL. plantarum KU210152細胞の生存率はそれぞれ98.67%と100.12%であった。 Lacticaseibacillus rhamnosus GGおよび L. plantarum KU210152 は、それぞれ 94.99 % および 96.68 % という高い胆汁酸塩耐性を示しました。 これらの結果は、両方の 乳酸菌株が胃腸条件下で生存できることを示しました。 プロバイオティクス微生物にとって、腸上皮細胞への接着能力は必須の基準です（Alp & Kuleas¸an、2019）。 L. plantarum KU210152は、Lacticaseibacillus rhamnosus GG細胞(1.71%)よりも腸細胞（HT-29）細胞に対して高い接着性(5.58%)を示した(表1)。 したがって、L. plantarum KU210152 は潜在的なプロバイオティクス株として使用できる可能性があります。 |
| 3.2. 酵素の生産 |
| 乳酸菌による酵素生成は、その潜在的な副作用と利点を解明するために調査されました (表 S2)。 β-グルクロニダーゼは発がん物質に関連する有害な酵素です (´Sli˙ zewska et al., 2020)。 しかし、Lacticaseibacillus rhamnosus GGおよび L. plantarum KU210152 は β-グルクロニダーゼを生成しませんでした (表 S2)。 グリコシド結合を加水分解するβ-グルコシダーゼは、豆乳発酵中のイソフラボンの吸収と生物学的利用能の向上に重要です (Rekha & Vijayalakshmi、2011)。 β-ガラクトシダーゼは乳糖をグルコースとガラクトースに加水分解し、乳糖不耐症の症状を軽減することができます (Son et al., 2018)。 本研究では、両方の 乳酸菌株が大量の β-ガラクトシダーゼと β-グルコシダーゼを生成しました。 したがって、L. plantarum KU210152 はプロバイオティクスとして安全に使用でき、発酵豆乳および乳製品中にその存在が存在することは消費者にとって有益です。 |
| 3.3. 過酸化水素（H2O2 ）誘発ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する 熱殺菌乳酸菌 (LAB CM)の効果 |
| 細胞毒性が高いため生細胞を使用できなかったため、馴化培地（CM） を神経保護効果の評価に使用しました。 熱殺菌乳酸菌 (LAB CM)の保護効果は、MTT アッセイを使用して評価されました。 神経保護効果を確認する前に、熱殺菌乳酸菌 (LAB CM)の細胞毒性を評価しました。 私たちは、Lacticaseibacillus rhamnosus GGと L. plantarum KU210152 の両方の馴化培地（CM）でそれを観察しました。 馴化培地（CM）グループでは、細胞生存率は > 100 % でした (図 1A)。 細胞生存率は、ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞をさまざまな濃度の 過酸化水素（H2O2 ）(0 ～ 300 μM、図 1B) に曝露することによって測定されました。 150 μM 過酸化水素（H2O2 ）では、細胞生存率は 50.92 % でした。 したがって、熱殺菌乳酸菌(LAB CM)実験には 150 μM 過酸化水素（H2O2 ）が使用されました。 過酸化水素（H2O2 ）(150 μM) に曝露すると、細胞生存率が 52.85 % に大幅に減少しました。 しかし、Lacticaseibacillus rhamnosus GG 馴化培地（CM）およびL. plantarum KU210152 馴化培地（CM）による前処理は、細胞死をそれぞれ58.75%および73.38%減少させた(図1C)。 L. plantarum KU210152 馴化培地（CM）は、過酸化水素（H2O2）処理グループと比較して細胞生存率を顕著に増加させました。 |
| 3.4. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の形態変化と活性酸素種（ROS）産生に対する熱殺菌乳酸菌（LAB CM）の影響 |
| アポトーシス細胞死には、細胞収縮、膜小疱形成、核の凝縮、アポトーシス細胞体などの形態学的変化が含まれます (Hollville & Martin、2016)。 図２Ａは、Ｈ２Ｏ２および熱殺菌乳酸菌（LAB CM）で処理した後のヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の形態学的変化を示す。 H2O2 で処理した細胞は、神経突起の消失、細胞の縮小、および凝集を示しました。 しかし、熱殺菌L. plantarum KU210152 （CM ）は細胞損傷を保護し、H2O2 のみで処理したグループと比較して細胞内に無傷の神経突起を示しました。 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (DCFH-DA) 法を使用して、H2O2 誘発 ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞における 活性酸素種（ROS） 生成を測定しました。 非蛍光化合物である2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテートは、細胞内エステラーゼによって加水分解されて蛍光2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン（DCFH）になります。 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインは酸化されて蛍光ジクロロフルオレセイン (DCF) になります (Mehri et al., 2012)。 図 2B に示すように、細胞を H2O2 に曝露すると 活性酸素種生成が有意に誘導されました。 しかし、熱殺菌L. plantarum KU210152による前処理は、活性酸素種産生を顕著に阻害した。 これは、L. plantarum KU210152 が 活性酸素種生成を抑制することによって神経保護効果を発揮することを示唆しています。 |
| 3.5. 相対的な遺伝子発現に対する加熱死滅乳酸菌および熱殺菌乳酸菌（LAB CM） の影響 |
| 成長因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである脳由来神経栄養因子（BDNF）は、ニューロンの生存、分化、およびシナプス可塑性を調節します (Binder & Scharfman、2004)。 脳由来神経栄養因子は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患に対して治療上の利点があります (Cheon et al., 2020)。 チロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、チロシンの L-DOPA への水酸化を触媒する重要な酵素です (Wang et al., 2002)。 チロシンヒドロキシラーゼは、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの損失を抑制します (Wang et al., 2002)。 |
| 熱で死滅させた細菌細胞の影響を調べるために、処理済みおよび未処理の 腸細胞（HT-29 ）の RNA を使用して リアルタイム-PCR を実行しました。 Lacticaseibacillus rhamnosus GGおよびL. plantarum KU210152は両方とも、脳由来神経栄養因子発現をそれぞれ1.31倍および1.35倍増加させた(図3A)。 さらに、L. plantarum KU210152 はチロシンヒドロキシラーゼ発現を有意に上方制御しました (1.54 倍)。 これらの結果は、L. plantarum KU210152 が神経バイオマーカーの発現を改善することによって神経保護効果を発揮することを示唆しています。 |
| 抗アポトーシス因子である Bcl-2 はミトコンドリア外膜に位置し、シトクロム C の放出を阻害します (Borner、2003)。 アポトーシス促進因子である Bax はサイトゾルに存在します。 Bax のミトコンドリア膜への移行により、ミトコンドリア膜の透過性が増加します。 最後に、シトクロム C の分泌とカスパーゼ カスケードの活性化が発生し、アポトーシスが誘導されます (Leist & J®a®attel®a、2001)。 Bax/Bcl-2 比は、アポトーシスの評価において個々の遺伝子の発現を比較するよりも、アポトーシスの評価に適しています (Raisova et al., 2001)。 |
| H2O2のみで処理した細胞は、未処理群と比較してBax/Bcl-2比が1.83倍増加したことを観察しました（図3B）。 しかしながら、熱殺菌したL. plantarum KU210152による前処理は、比率を0.91倍減少させ、これは熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGによって観察された効果(0.95倍)と同様である。 |
| 脳由来神経栄養因子およびチロシンヒドロキシラーゼの発現は、H2O2 で処理した細胞では減少しました (図 3C)。 熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGまたは熱殺菌した L. plantarum KU210152による処理により、脳由来神経栄養因子発現はそれぞれ 1.36 倍および 1.93 倍増加しました。 さらに、熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGおよび 熱殺菌したL. plantarum KU210152 は、チロシンヒドロキシラーゼの発現をそれぞれ 1.42 倍および 3.25 倍上方制御しました。 脳由来神経栄養因子およびチロシンヒドロキシラーゼ発現の増加は、熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGよりも熱殺菌したL. plantarum KU210152の方が高かった。 L. plantarum KU210152 は、アポトーシス関連遺伝子の発現を減少させ、神経バイオマーカーの発現を増加させることにより、顕著な神経保護効果を発揮します。 |
| 3.6. カスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 活性に対する 熱殺菌乳酸菌（LAB CM ）の影響 |
| シトクロム C の放出は、カスパーゼ 9 を活性化するアポトーシス プロテアーゼ活性化因子 1 に結合することにより、アポトソーム複合体の形成を誘導します。 活性化されたカスパーゼ-9 はカスパーゼ-3 とカスパーゼ-3 を活性化し、DNA の断片化、分解、およびアポトーシスを引き起こします (Vodovotz et al., 2004)。 |
| 図 4A では、H2O2 への曝露により、カスパーゼ 9 活性が対照群と比較して 156.26% 増加しました。 しかし、熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGおよび熱殺菌した L. plantarum KU210152は、酵素活性をそれぞれ 101.74% および 92.37% 改善しました。 カスパーゼ-3 活性も熱殺菌した L. plantarum KU210152処理後に減少しました。 H2O2で処理した細胞では酵素活性が173.37%増加しました（図4B）。 熱殺菌したLacticaseibacillus rhamnosus GGまたは 熱殺菌したL. plantarum KU210152で前処理した後、酵素活性はそれぞれ 116.86 % および 99.55 % 減少しました。 これらの結果は、熱殺菌したL. plantarum KU210152がカスパーゼ 9 およびカスパーゼ 3 の活性を阻害することによって ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞のアポトーシスを防止できることを示しています。 |
| 3.7. 豆乳発酵中および冷蔵保存中のpH、滴定酸度、生存乳酸菌の変化 |
| 発酵中の 3 つの異なる発酵豆乳サンプルの pH、滴定酸度、生菌数の変化を図に示します。 5A～C。 3 つのサンプルの初期 pH は約 6.7 でした。 3 つのサンプルすべてで、6 時間の発酵中に pH が徐々に低下しました。Streptococcus thermophilu P206 で発酵させた豆乳、Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳およびLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルの最終 pH 値は、それぞれ 4.6、4.4、および 4.5 でした。 さらに、滴定酸度の値は 3 つのサンプルすべてで徐々に増加しました。 Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳ンプルは 0.10 % から 0.60 % への最も高い変化を示しました。 これに Lactiplantibacillus plantarumKU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプル (0.10 % ～ 0.50 %) が続きましたが、Streptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルは 0.10 % ～ 0.47 % の最も低い増加を示しました。 生存細菌細胞の総数は徐々に増加しました。 3 つのサンプルでは、初期生細胞数は 7.22 ～ 7.54 log CFU/mL、最終細胞数は 8.87 ～ 9.00 log CFU/mL でした。 |
| 21 日間の冷蔵保存中、pH、滴定酸度、および生存乳酸菌を毎週測定しました (図 5D ～ F)。 Streptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳、Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳およびLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルは、21 日後も一定の pH および 滴定酸度の値を示しました。 ただし、生きた細菌細胞の総数は、3 つの発酵豆乳サンプルすべてでわずかに減少しました。 21 日間の保存後、Streptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプル中の生存 乳酸菌数は 8.80 log CFU/mL から 8.45 log CFU/mL に減少し、Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプル中の生存乳酸菌数は 8.92 log CFU/mL から 8.24 log CFU/mL に減少しました。 Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプル中の生存乳酸菌数の変化は、8.62 log CFU/mL から 7.96 log CFU/mL の範囲でした。 3 タイプの中で最も減少率が低かったのはStreptococcus thermophilus P206 で発酵させた豆乳タイプでした。 保存中のLacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルとLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルの減少は同様でした。 生存可能な乳酸菌の数の減少は、発酵豆乳中の栄養素の濃度に依存します(Choi et al.,2022)。 |
| 3.8. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞に対する豆乳発酵液の影響 |
| 発酵豆乳上清の細胞毒性を 3 つの異なる濃度 (1、1/2、および 1/4 希釈) で測定しました。 MTT アッセイにより、3 つの発酵豆乳上清の 1 希釈サンプルの細胞生存率が < 40 % であることが明らかになりました (図 6A)。 1/2、1/4希釈の3種類の豆乳発酵上清はほぼ100％の生存率を示した。 細胞生存率は、さまざまな濃度の H2O2 (0 ～ 300 μM) に曝露した後、用量依存的に徐々に減少しました (図 6B)。 200 μM H2O2 での処理により、細胞生存率は 48.32 % となりました。 したがって、1/2 および 1/4 に希釈した発酵豆乳上清と 200 μM H2O2 をその後の発酵豆乳実験に使用しました。 H2O2で処理した細胞は45.68%の生存率を示した(図6C)。 1/2 および 1/4 に希釈したLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルは両方とも、細胞生存率をそれぞれ 57.38 % および 63.57 % 改善しました。 Lacticaseibacillus rhamnosus GG と S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルも 1/4 希釈濃度 (55.59 %) で H2O2 処理群よりも高い細胞生存率を示しましたが、その値はLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳の値より低かったです。 |
| 3.9. ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の形態変化と活性酸素種（ROS）産生に対する発酵豆乳の影響 |
| Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルの保護効果は、ヒト神経芽腫（SH-SY5Y）細胞の形態学的変化に基づいて特定されました (図 7A)。 H2O2 による処理により、神経突起が消失し、細胞が縮小しました。 Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳(1/4 希釈) による前処理により、細胞損傷が改善されました。 Lactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳 (1/4 希釈) で処理した細胞は、正常な神経突起と縮小した収縮を示しました。 これらの結果は、プロバイオティクス L. plantarum KU210152 で発酵させた豆乳が神経変性疾患に対して効果的な機能性食品である可能性を示唆しました。 図７Ｂは、発酵豆乳上清およびH２O２ で細胞を処理した後の活性酸素種生成を示す。 H2O2 のみへの曝露は、対照群と比較して活性酸素種生成を有意に誘導しました。 3 つの発酵豆乳上清のうち、1/4 に希釈したLactiplantibacillus plantarum KU210152 および S. thermophilus P206 で発酵させた豆乳サンプルでは活性酸素種生成が顕著に減少しました。 この研究では、L. plantarum KU210152 で発酵させた豆乳が、活性酸素種の生成を阻害することで神経保護効果を発揮しました。 |
| 4. 結論 |
| 本研究では、L. plantarum KU210152 のプロバイオティクス特性と神経保護効果を評価しました。 L. plantarum KU210152 は、人工胃腸状態に対する高い耐性、腸細胞（HT-29）への高い接着性、および有益で安全な酵素の産生を示しました。 熱殺菌したL. plantarum KU210152による前処理により、過酸化水素（H2O2 ）による ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の生存率の低下と形態学的損傷が軽減されました。 熱殺菌したL. plantarum KU210152は神経における活性酸素種生成を抑制した。 さらに、L. plantarum KU210152 は、アポトーシス関連遺伝子の発現を減少させ、神経バイオマーカーのレベルを増加させました。 カスパーゼ-9 およびカスパーゼ-3 の活性は、熱殺菌したL. plantarum KU210152による前処理によって阻害されました。 さらに、L. plantarum KU210152 および S. Thermophilus P206で発酵させた豆乳サンプルは、H2O2 処理ヒト神経芽腫（SH-SY5Y ）細胞の生存率と形態学的変化を弱めました。 L. plantarum KU210152 および S. Thermophilus P206で発酵させた豆乳サンプル サンプルは 活性酸素種の生成も抑制しました。 したがって、L. plantarum KU210152 にはプロバイオティクス、神経保護、抗酸化特性があり、神経変性疾患を予防するための発酵食品の予防成分として使用できます。 |
| 参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
| この文献は、Food Research International 177 (2024) 113868に掲載されたProbiotic Lactiplantibacillus plantarum KU210152 and its fermented soy milk attenuates oxidative stress in neuroblastoma cells.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |