KKAyマウスにおけるシアニジン3,5-ジグルコシドによる血糖値とHbA1cレベルの低下

Takuya Yamane, Momoko Imai, Satoshi Handa, Keiko Yamada, Tatsuji Sakamoto, Testuo Ishida, Hiroshi Inui, Yoshio Yamamoto,
Takenori Nakagaki, Yoshihisa Nakanoa

 

Journal of Functional Foods 58 (2019) 21–26

 

要約

アロニアメラノカルパは、生活習慣病に有益な効果があります。私たちの以前の研究は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)活性がアロニアジュースからのシアニジン3,5-ジグルコシドによって阻害され、アロニアジュースを与えられたマウスの脂肪組織の重量も減少したことを示しました。この研究の目的は、in vivoでのDPP IV活性の阻害を通じて、2型糖尿病に対するアロニアジュースを含むシアニジン3,5-ジグルコシドの効果を調査することです。2型糖尿病および肥満モデルのKKAyマウスを、各グループに5匹のマウスを含む3つのグループに分けました。すなわち、水を与えられた対照群、アロニアジュースを与えられたアロニア群、およびシアニジン3,5-イグルコシド溶液を与えられたcydg群である。

増加した血中グルコースとヘモグロビンA1cレベルは、シアニジン3,5-ジグルコシドを投与されたKKAyマウスで減少しましたが、白い脂肪組織の重量は減少しませんでした。これらの結果は、シアニジン3,5-ジグルコシドには抗糖尿病効果があるが抗肥満効果はないことを示唆しています。

 

はじめに

アロニアベリー(Aronia melanocarpa)は、ロシアおよび東ヨーロッパ諸国の伝統医学で使用されています(Kokotkiewicz、Jaremicz、&Luczkiewicz、2010)。アロニアベリーはフェノール性植物化学物質の含有量が高く、アロニアベリーの濃度はクランベリーの濃度よりも5倍以上高くなっています(Wu et al.、2004、2006)。2型糖尿病は多くの国で公衆衛生上の課題となっています(国際糖尿病連合、2017年)。DPP IV阻害剤、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)受容体アゴニスト、ナトリウムグルコース共輸送体2阻害剤などの血糖降下薬は、過去10年間に使用されています(Sterrett、Bragg、&Weart、2016)。
糖化ヘモグロビン(HbA1c)の減少は、血糖コントロールと微小血管合併症の予防のための十分に検証された代理として認められています(European Medicines Agency、2012)。HbA1cレベルは、さまざまな糖尿病治療法に関する多くの試験で標準的な結果指標となっています(米国保健社会福祉省食品医薬品局、2008年)。アロニアベリーとその誘導体は、抗糖尿病効果があります。
動物モデル研究では、高血糖は、アロニアジュースを与えられた糖尿病ラットで軽減されました(Valcheva-Kuzmanova、Kuzmanov、Tancheva、およびBelcheva、2007)。アロニア抽出物を与えた動物では空腹時血糖値が低下しました(Qin&Anderson、2012)。アロニアジュースを与えられたアロキサン誘発糖尿病のラットでは、血糖値が大幅に低下しました(Oprea、Manolescu、Fărcăşanu、Mladin、およびMihele、2014)。アロニアジュースを含む高脂肪食を与えられたラットでは、耐糖能が改善されました(Bhaswant、Shafie、Mathai、Mouatt、およびBrown、2017)。人間の介入研究において、空腹時血糖値は、インスリン非依存性糖尿病患者のアロニアジュースによって低下しました(Simeonov et al。、2002)。また、食事前にアロニアジュースを飲むと、精巣上体の血糖値も低下しました(Yamane et al.、2017)。
これらの研究は、アロニアが血糖値の低下と糖尿病の改善に非常に有用であることを示しましたが、メカニズムの大部分は解明されていません。 私たちの以前の研究では、アロニアジュースの成分の1つであるシアニジン3,5-ジグルコシドは、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)活性を阻害します(Kozuka et al.、2015)。DPP IV(EC 3.4.14.5)はエキソペプチダーゼ(Ohkubo、Huang、Ochiai、Takagaki、およびKani、1994)であり、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)およびインスリン分泌性ペプチド(GIP)と同様にインクレチンを分解します。インクレチンは膵臓からのインスリン分泌を刺激して血糖値を低下させます(Baggio&Drucker、2007; Kieffer、McIntosh、&Pederson、1995; Mentlein、1999; Pridal et al。、1996)。したがって、DPP IV阻害剤により血糖値が低下します。 私たちの以前の研究は、アロニアジュースを与えられたKKAy糖尿病と肥満モデルマウスで血糖値と白い脂肪組織の重量が減少したことを示しました(Yamane et al。、2016)。しかし、生体内の糖尿病におけるシアニジン3,5-ジグルコシドの効果は明らかではない。この研究では、血糖値の低下に関する以前の研究でアロニアジュースに存在するDPP IV阻害剤として特定されたシアニジン3,5-ジグルコシドの効果を明らかにするために、シアニジン3,5-ジグルコシドをKKAyマウスに投与し、血糖値とHbA1cレベルと白い脂肪組織の重量を測定しました。さらに、2型糖尿病と肥満に対するシアニジン3,5-ジグルコシドの効果についても説明します。

 

2 材料と方法

2.1 材料

アロニアジュースは、中垣技術士事務所(大阪府)から提供されました。 シアニジン3,5-ジグルコシドおよびシアニジン3-Oグルコシドは、EXTRASYNTHESE(フランス、リヨン)から購入しました。シアニジン3-O-ガラクトシドとシアニジン3-O-アラビノシドはTOKIWA(千葉、日本)から購入しました。血糖値のHbA1cカートリッジとストリップは、SIEMENS(東京、日本)とNova Biomedical(マサチューセッツ、米国)からそれぞれ提供されました。 Gly-Pro-MCAおよびGLP-1 ELISAキットは、それぞれPeptide Institute(大阪、日本)およびIBL(群馬、日本)から購入しました。他のすべての化学薬品は分析グレードのものであり、和光純薬(大阪、日本)から購入しました。

2.2 動物

KKAy雄マウスは、4週齢のCLEA Japan(東京、日本)から入手しました。 すべてのマウスに通常の食事を与えた(CE2食事、日本CLEA日本、東京、日本)。4日後、KKAyマウスを各グループ5匹のマウスの3つのグループに分けました:水を与えられたコントロールグループ、アロニアジュースを与えられたアロニアグループ、および10μg/ mLの溶液が与えられたcy-dgグループ 水で調製したシアニジン3,5-ジグルコシド(純度99.7%)。アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシド溶液は自由摂取で与えられました。食餌療法を開始してから49日後に、マウスをイソフルラン麻酔により犠牲にした。血清、肝臓、小腸、腎臓および脂肪組織を分離し、重量を測定した。

2.3 血糖値とHbA1cレベル

血糖値は、小型の血糖測定装置、Xpress 900(Nova Biomedical、マサチューセッツ、米国)を使用して測定されました。HbA1cレベルは、DCA Vantage Analyzer(SIEMENS、東京、日本)を使用して測定されました。

2.4 DPP IVアクティビティ

酵素活性は、10 mM基質Gly-Pro-4-メチル-クマリンアミド10μl、100μLの0.5M Tris-HCl(pH 9.0)、5μLの酵素溶液、ミリQ水(18mΩ)、総量1 mlを含む混合物中、37°Cでの7-アミノ4-メチルクマリンの遊離の蛍光定量(励起、380 nm;発光、440 nm)によって測定されました。 30分間インキュベートした後、2Mの0.2M酢酸を混合物に加えて反応を停止させた。

2.5 GLP-1とインスリンの酵素免疫測定法

GLP-1の血中濃度は、哺乳類のアクティブGLP-1測定キット(IBL、群馬、日本)を使用して測定されました。

2.6 肝臓トリグリセリド含有量の分析

肝臓のトリグリセリド含有量は、以前に記載されているように測定されました(Blige&Dyer、1958)。簡単に言うと、肝臓組織(50 mg)を0.1 M酢酸で均質化し、1.8 mlのメタノール-クロロホルム(2:1、v / v)を加えました。遠心分離後、下層のクロロホルム層を回収し、残留物を0.5mlのクロロホルムで洗浄した。合わせたクロロホルム層を風乾した。 ペレットを10%Triton X-100を含む2-プロパノールに溶解した。トリグリセリド濃度は、和光トリグリセリドEテスト(和光、大阪、日本)を使用して測定しました。

2.7 アロニアジュースからのアントシアニンの抽出

アントシアニンの抽出は、Vieira et al(Vieira、Marques、Machado、Silva、およびHubinger、2017)によって記載された方法にいくつかの変更を加えて行われました。ワコーゲル50C18(富士フイルム和光ケミカルズ)1gを小さなガラスカラムに入れ、酢酸エチル、メタノール、水で順に洗浄した。この事前調整済みカラムに5 mLのアロニアジュースを入れ、カラムを約5 mlの水で、次に約10 mlの酢酸エチルで洗浄しました。結合したアントシアニンを、0.1%ギ酸を含む水中の90%メタノールで溶出しました。1.5 mlチューブに300μLのアリコートを含む画分を、遠心エバポレーターを使用して真空下でほぼ乾固するまで濃縮しました。チューブ内のサンプルを、HPLC分析に使用する平衡化溶媒300μLに再溶解しました(以下を参照)。

2.8 アントシアニンのHPLC分析

アントシアニンのHPLC分析は、Gouvȇaet al(Gouvȇaet al。、2015)によって記載された方法に従って、いくつかの変更を加えて行われました。Shimadzu HPLCシステムを使用してクロマトグラフィー分析を行い、分離はCosmosil 3C18-EBカラム(2.0mm ID×150 mm、ナカライテスク)で行いました。溶媒Aは水中に5%のギ酸を含み、溶媒Bは5%のギ酸、90%のメタノールおよび5%の水を含んでいた。カラムは10%Bで平衡化しました。サンプルとキャリブレーション標準溶液(10%Bで1.25〜10μmol/ L)の50μLを40μLのサンプルループにロードしました。アントシアニンは、次の時間プログラムを使用して溶出されました。0〜10分、10%B。 10〜50分、メタノールが10%Bから50%Bに直線的に増加。 51〜59分、90%B。流量は100μL/ min、カラム温度は20°Cでした。アントシアニンの溶出は、520 nmの吸光度を測定することで監視しました。アロニア果汁のアントシアニン含有量を表1に示した。

表1 アロニアジュースのアントシアニン含有量

T1

すべてのデータは、4つの複製の平均±標準偏差として表されます。
 

2.9 統計分析

データは平均±標準誤差として表されます。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く対応のないスチューデントのt検定を使用して実行されました。 複数のサンプルの比較には、Tukey–Kramer検定を使用しました。

2.10 倫理声明
動物実験はすべて国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施され、プロトコルは大阪府立大学の動物研究委員会によって承認されました(許可番号:30–89)。
 
3.結果
3.1 シアニジン3,5-ジグルコシドによる血糖値とHbA1cレベルの低下
シアニジン3,5-ジグルコシドが血糖値とHbA1cレベルに及ぼす影響を調べるために、水、アロニアジュース、シアニジン3,5-ジグルコシドを含む溶液を、対照群、アロニア群、cy-dg群のマウスに経口投与しました。図1Aに示すように、投与開始21日後のアロニア群およびcy-dg群の血糖値は、それぞれ対照群の約39%、60%であった。 一方、アロニア群およびcy-dg群の血糖値は、投与開始後49日で対照群と比較して、それぞれ約58%、95%であった。投与開始24日目からcy-dg群、35日後のアロニア群で血糖値が上昇した。 さらに、アロニア群およびcy-dg群のHbA1cレベルは、投与開始21日後に対照群のHbA1cレベルのそれぞれ約67%および84%でした。 一方、アロニア群およびcy-dg群のHbA1c値は、投与開始49日後の対照群と比較して、それぞれ約56%、77%であった(図1B)。
 
図1.対照マウスとシアニジン-3,5-ジグルコシドまたはアロニアジュースを投与したマウスの血糖値とHbA1cレベルの違い。
T1
アロニアジュースは、シアニジン-3,5-ジグルコシドに対する陽性対照として使用されました。マウスの血中グルコース(A)およびHbA1c(B)レベルは、49日間3または4日ごとに測定されました。対照マウスとシアニジン-3,5-ジグルコシドまたはアロニアジュースを与えられたマウスとの間には有意差がありました。 * p <0.05、** p <0.01、n = 5。
 
3.2 シアニジン3,5-ジグルコシドを与えられたKKAyマウスにおけるDPP IV活性の阻害
投与開始から49日後にマウスより血清を採取し、DPP IV活性を測定した。 図2に示すように、コントロールグループの血清DPP IV活性は、cy-dgおよびアロニアグループのそれよりも有意に高かった。DPP IV活性の阻害は、アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスの血清で観察され、それらの活性は、コントロールグループのそれらのそれぞれ約38%と74%でした。
 
図2 血清中のDPP IV活性
T2
水またはアロニアジュースまたはシアニジン-3,5-ジグルコシドをマウスに経口投与した。 49日後、血清を採取し、DPP IV活性を測定した。 * p <0.05、** p <0.01、n = 5。
 
3.3 血清中の活性GLPレベル
投与開始から49日後にマウスより血清を採取し、活性型GLP-1値を測定した。図3に示すように、cy-dgおよびアロニアグループの血清GLP-1レベルは、コントロールグループの血清GLP-1レベルと比較して大幅に増加しました。アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシドを与えられたKKAyマウスからの血清中のアクティブなGLP-1レベルの増加は、それぞれコントロールグループのそれらの約10倍と6.4倍でした。
 
図3.血清中のアクティブなGLP-1レベル
F3
血清中のELISAにより、活性型GLP-1のタンパク質レベルを調べた。 * p <0.05、** p <0.01、n = 5。
 
3.4 シアニジン3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスの肝臓および白色脂肪組織の重量
投与開始から49日後に、マウスより肝臓および白色脂肪組織を摘出し、秤量した。図4に示すように、対照群と比較してアロニアジュースを投与したKKAyマウスの肝臓および白色脂肪組織の重量は有意に減少しましたが、シアニジン3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスの肝臓および白色脂肪組織の重量は、有意に減少しなかった。
 
図4. アロニアジュースを投与したKKAyマウスは組織重量の減少したが、シアニジン-3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスは組織重量の減少しなかった
A. 精巣上体の白色脂肪組織
F4A
B. 肝臓
F4B
水、シアニジン-3,5-ジグルコシドまたはアロニアジュースをマウスに経口投与した。49日後、精巣上体の白色脂肪組織(A)と肝臓を採取し、体重を測定しました。 * p <0.05、n.s .:重要ではない。 n = 5。
 
3.5 シアニジン3,5-ジグルコシドを与えられたKKAyマウスからの肝臓における脂質蓄積
投与開始から49日後にマウスより肝臓を摘出し、中性脂肪値を測定した。図5に示すように、アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスの肝臓のトリグリセリドレベルは、それぞれコントロールグループの約50%と95%でした。
 
図5 アロニアジュースを投与されたKKAyマウスの肝臓トリグリセリドレベルの変化したが、シアニジン-3,5-ジグルコシドでは変化しなかった
F5
コントロールおよびアロニアジュースまたはシアニジン-3,5-ジグルコシド投与マウスの肝臓のトリグリセリドレベルを測定した。 * p <0.05、n.s .:重要ではない。 n = 5。
 
4.考察
本研究では、アロニアジュースまたはシアニジン3,5-ジグルコシドを投与することにより、血糖値とHbA1cレベルが低下することを明らかにしました。しかしながら、シアニジン3,5-ジグルコシドの投与による血中グルコースとHbA1cの減少の大きさは、KKAyマウスにアロニアジュースを与えることによるそれらの約50%でした。私たちの以前の研究では、アロニアジュースを与えられたKKAyマウスの血糖値は、DPP IVと血清ではなく小腸のα-グルコシダーゼ活性を阻害することによって減少しました(Yamane et al.、2016)。  興味深いことに、血清DPP IV活性は、49日間アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシドを投与されたKKAyマウスで抑制されました。シアニジン3,5-ジグルコシドを与えることによるDPP IV活性の阻害率は、アロニアジュースを与えることによるものの約50%でした。シアニジン3,5-ジグルコシドを与えることによるKKAyマウスからの血清中の活性GLP-1のレベルの増加も、アロニアジュースを与えることによるそれの約64%でした。
アロニアジュースを与えられたKKAyマウスの血糖値とHbA1cレベルの低下は21日目からわずかに増加し始めましたが、シアニジン3,5-ジグルコシドを与えられたKKAyマウスのそれらは同じ日から急激に増加しました。血糖値とHbA1cレベルのこれらの異なる上昇曲線は、α-グルコシダーゼ阻害剤などの他の化合物がアロニアジュースに存在することを示唆しています。これらの結果は、アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシドが2型糖尿病の予防に非常に効果的であることも示しています。
さらに、シアニジン3,5-ジグルコシドを与えられたKKAyマウスからの血清におけるDPP IV阻害活性と増加したアクティブGLP-1レベルは、アロニアジュースを与えられたKKAyマウスからの血清のそれらの約50%でした。シアニジン3,5-ジグルコシドの摂取量も、cy-dg群と比較してアロニア群で低かった(表2)。
 
表2シアニジン3,5-ジグルコシドの摂取量
T2
すべてのデータは、5匹の動物の平均±標準誤差として示されています。
 
これらの結果は、アロニアジュースに他のDPP IV阻害剤が存在することを示しています。アロニアジュースには少なくともシアニジン3-O-グルコシド、シアニジン3-O-ガラクトシド、シアニジン3-O-アラビノシドが含まれていたため、これらのアントシアニンはシアニジン3,5-ジグルコシドでDPP IV活性を阻害しました。  多くのポリフェノールがアロニアベリーに含まれていることが報告されています(Xie et al.、2016)。DPP IVやアンジオテンシン変換酵素などのプロテアーゼの活性は、ベリーを含む植物からのこれらのポリフェノールによって阻害されました(Yamane、2018)。

DPP IV活性は、シアニジン3-O-グルコシド、ケルセチン、シアニジンなどのいくつかのポリフェノールによって阻害されました(Yamane、2018)。 シアニジン3-O-グルコシドのDPP IV阻害活性は、シアニジンのそれよりも高かった(Kalhotra、Chittepu、Osorio-Revilla、およびGallardo-Velázquez、2018)。DPP IV活性は、シアニジン3-O-グルコシドよりもシアニジン3,5-ジグルコシドによって阻害された(Kozuka et al.、2015)。 一方、α-グルコシダーゼ活性はアロニア果汁を与えることによっても阻害され(Yamane et al.、2016)、アントシアニンなどのポリフェノールはα-グルコシダーゼ活性を阻害します(McDougall&Stewart、2005)。これらのポリフェノールはアロニアジュースに含まれているため、シアニジン3,5-ジグルコシドとこれらのポリフェノールの組み合わせによるDPP IVおよびα-グルコシダーゼ活性の阻害により、アロニアジュースを与えることによる血糖値とHbA1cレベルの低下が発生する可能性があります。

一方、アロニアジュースを投与したKKAyマウスの肝臓と白色脂肪組織の重量は減少しましたが、シアニジン3,5-ジグルコシドを投与したKKAyマウスの重量は減少しませんでした。さらに、肝臓のトリグリセリドレベルは、アロニアジュースを与えることによって減少しましたが、シアニジン3,5-ジグルコシドを与えることによっては減少しませんでした。アロニアジュースを与えることによる白い脂肪組織の減少が報告されているため(Yamane et al.、2016)、アロニアジュースを含む別の化合物が白い脂肪組織に影響を与える可能性があります。これらの結果は、アロニアジュースに含まれるシアニジン3,5-ジグルコシドが糖尿病に有益な効果をもたらすが、肥満には効果がないことを示唆しています。
さらなる研究では、アロニアジュース中のシアニジン3,5-ジグルコシド以外の抗糖尿病化合物を特定し、膵島細胞やインスリン抵抗性との関連を含む、2型糖尿病に対するアロニアジュースの治療効果を調べる必要があります。 アロニアジュース中の抗肥満化合物の同定も重要です。

 

 

 

 

この文献はJournal of Functional Foods 58 (2019) 21–26 に掲載された

Reduction of blood glucose and HbA1c levels by cyanidin 3,5-diglucoside in KKAy mice

を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。