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更新2021.01.27

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文献調査（発酵乳、腸内細菌の科学：研究の最前線）

ブラックチョークベリー（アロニア・メラノカルパ）果汁の摂取は、

高齢ラットの精巣における酸化ストレスと老化マーカーを改善する

Elena Daskalova, Mina Pencheva, Petko Denev,

Curr Issues Mol Biol. 2024 May 8;46(5):4452–4470.

概要

　精子形成は個体の生涯を通じて継続するプロセスですが、加齢とともにその活性は低下します。炎症、酸化、アポトーシスは、老化精巣にみられる加齢関連疾患の病因および発症の予測因子と考えられています。抗酸化作用および抗炎症作用を持つ天然化合物の使用は、老化精巣の炎症および酸化状態に有益な効果をもたらします。本研究の目的は、抗酸化物質を豊富に含むブラックチョークベリー（アロニア・メラノカルパ）果汁の補給が、ラット精巣における酸化ストレスおよび老化の複数のマーカーに及ぼす影響を明らかにすることです。合計24匹の雄Wistarラットを3つの実験群に分け、2ヶ月齢の若齢対照群、27ヶ月齢の高齢対照群、およびブラックチョークベリー果汁を10 mL/kgの用量で3ヶ月間補給した27ヶ月齢ラットを試験しました。アロニア・メラノカルパ果汁の補給は、精細管およびライディッヒ細胞におけるnNOS、eNOS、およびMAS1の免疫発現の増加に表れ、酸化ストレスの減少につながりました。形態計測学的に測定された精細管構造データでは、3群間に有意差は認められませんでした。しかし、ライディッヒ細胞におけるTRK-CおよびNT3に対する免疫反応の強度は、補給を受けた高齢動物では、高齢対照群と比較して明らかに高くなっていました。また、補給を受けた高齢動物では、精細管周囲の血管数が高齢対照群と比較して有意に増加していました。これらのデータは、アロニア・メラノカルパ果汁の補給が精巣の老化プロセスを遅らせ、ライディッヒ細胞の機能活性を維持することを示しています。

目次(クリックして記事にアクセスできます）

1.はじめに

2. 材料と方法

　2.1. アロニア・メラノカルパ果汁の分析と組成

　2.2. 動物

　　3.4.1. TRK-CおよびNT3に対する免疫反応

　　3.4.2. nNOS、eNOS、およびMAS1免疫反応

4. 考察

　4.1. 形態学的変化

　4.2. TRK-CおよびNT3免疫反応

　4.3. nNOS、eNOS、およびMas1免疫反応

　4.4. ライディッヒ細胞の抗酸化物質とステロイド生成機能

5. 結論

本文

1.はじめに

　老化は、様々な内因性因子および環境因子によってあらゆる臓器に不可逆的な変化をもたらす自然現象であり、精巣の変化は男性生殖器系における老化の影響の一つです。これらの変化は精子の質と量の低下につながる可能性があり、これはテストステロン値の低下とも関連しています[1,2,3]。さらに、加齢に伴う精巣機能の低下は、全体的な健康状態と生活の質にも影響を与えます[4]。加齢に伴う進行性精巣退縮の発症時期は明確には分かっていません[5]。精巣における加齢変化は、精子形成上皮とセルトリ細胞およびライディッヒ細胞の両方に影響を及ぼし、これらの細胞では変性症状が観察されます[6]。老化精巣における最も一般的な組織学的所見は、精細管における精子形成の変化です。ヒトとげっ歯類の両方において、加齢に伴う萎縮は局所的に始まり、萎縮した精巣細管は正常な精子形成を行う精巣細管に隣接して発生します。精巣組織は代謝活動と細胞複製が活発なため、酸化ストレスは特に有害となる可能性があり、抗酸化能が特に重要となります[5,7]。

　さまざまな研究結果によると、成熟した精子の細胞質の量が限られていること、精子中に活性酸素を抑制する抗酸化物質が集中していること、精子構造中に不飽和脂肪酸が高濃度に含まれていることなどの理由で、精子は他の細胞よりも酸化ストレスの影響を受けやすいことが分かっています[8]。

　ラットでは、加齢とともに酵素性および非酵素性抗酸化物質の発現が低下し、酸化ストレスによるダメージが増加することが証明されています。さらに、抗酸化物質であるグルタチオンのレベルも高齢ラットで低下します[9]。

　正常な精子機能（例えば、受精能獲得、過剰活性化、先体反応、受精など）には、低レベルの活性酸素種（ROS）が必要である[10]。最近、高齢マウスにおける酸化ストレスレベルの上昇が精巣ステロイド産生を低下させ、糖代謝障害がアディポネクチン受容体の減少と相関していることが示された[11]。活性酸素種の存在とそれに伴う酸化ストレスはアポトーシスと密接に関連しているため、加齢に伴うヒト精巣におけるアポトーシスの増加は、少なくとも部分的には、高齢精巣における活性酸素種の蓄積によって説明できる[12]。

　近年、腎臓および心血管機能の内分泌調節因子としてのレニン・アンジオテンシン系（RAS）の機能が再検証されている [13]。さまざまな臓器における局所的レニン・アンジオテンシン系の重要性が高まっている。プロレニン、レニン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン (Ang) I、アンジオテンシン II、アンジオテンシン変換酵素 (ACE)、およびアンジオテンシン変換酵素 2 など、レニン・アンジオテンシン系のいくつかの構成要素がヒトおよび哺乳類の精巣および精巣上体で同定されたことは、男性の生殖における局所的レニン・アンジオテンシン系の存在および関与を強く支持する [14,15,16,17,18]。この局所的レニン・アンジオテンシン系の要素の発現は、ヒトの生殖器のさまざまな部分で報告されている [13,19]。多数の遺伝子解析およびタンパク質解析により、ヒトおよび動物の精巣、精嚢、精巣上体、および前立腺にレニン・アンジオテンシン系構成要素が存在することが確認されている [14,20]。アンジオテンシン2はアンジオテンシンのヒトホモログであり、ヒトおよび動物の心臓、腎臓、精巣で高発現しています。複数の研究により、精巣におけるアンジオテンシン2の発現はラットではライディッヒ細胞、ヒトではライディッヒ細胞とセルトリ細胞に限定されていることが明らかになっています[21,22,23]。著者らはまた、アンジオテンシン2が精巣機能の制御に関与し、ライディッヒ細胞におけるステロイド産生やその他の機能の調節にも関与している可能性を示唆しています[24]。

　神経栄養因子の機能は、ニューロンの生存と分化を維持することですが、既知の神経栄養因子とその受容体はすべて精巣で発現していることも実証されています [25]。動物では、チロシンプロテインキナーゼ受容体（TRK）ファミリーの3つのメンバーが知られています。神経成長因子（NGF）に結合するチロシンプロテインキナーゼ受容体-A、脳由来神経栄養因子（BDNF）と神経栄養因子4（NT-4）に結合するチロシンプロテインキナーゼ受容体-B、および神経栄養因子3（NT3）に結合するチロシンプロテインキナーゼ受容体-Cです [26]。精巣胚発生の過程では、神経栄養因子とその受容体は発生過程を通じて生殖細胞で発現し、セルトリ細胞とライディッヒ細胞の体細胞でも発現します [26]。神経栄養因子は、出生後のライディッヒ細胞の分化や、オートクリンおよびパラクリン機構によるステロイド産生の調節にも役割を果たしていることが示されています [27]。

　一酸化窒素（NO）は反応性窒素種であり、血管新生、成長、思春期、老化などの重要な生理学的メカニズムを媒介する重要な分子であると考えられています[28]。一酸化窒素合成酵素（NOS）は、一酸化窒素の合成を担っています。これまでに、動物細胞では3つの一酸化窒素合成酵素アイソフォーム、すなわち神経性一酸化窒素合成酵素（nNOSおよびNOS 1）、誘導性NOS一酸化窒素合成酵素（iNOSおよびNOS 2）、および内皮性一酸化窒素合成酵素（eNOSおよびNOS 3）が発見されています[29]。男性の生殖系では、一酸化窒素は正常な生殖と生殖細胞のアポトーシスの調節に重要な役割を果たしています[28]。さらに、この単純な分子は、生殖細胞の進化、血液精巣関門におけるセルトリ細胞と生殖細胞の結合、生殖細胞のアポトーシスなど、他の役割にも関与しています。さらに、正常および病的な精巣組織の両方に広く分布するため、一酸化窒素は男性の妊孕性における重要な要因であると考えられている[28]。一酸化窒素/一酸化窒素合成酵素の生理的役割は、一酸化窒素を介した様々なシグナル伝達経路のため多岐にわたる[30,31]。例えば、一酸化窒素は炎症における重要な調節因子として関与しており[31]、内分泌系の生理的調節因子でもある[32]。精巣では、一酸化窒素合成酵素が精子の運動性と成熟、生殖細胞のアポトーシスなど、さまざまな機能を調節することが示されている[32]。特に、精子の運動性における一酸化窒素の最初の重要性は、精子中に3種類の一酸化窒素合成酵素（eNOS、iNOS、およびnNOS）すべてが存在することを示す局在研究に由来する[33]。これらの結果は、精子の正常な機能における一酸化窒素/一酸化窒素合成酵素の重要な役割を示唆していると思われる[32]。

　高齢者の精巣機能の改善を目的とした天然産物の適用は、貴重な予防戦略です。植物に含まれるポリフェノール化合物などの栄養素は、さまざまな調節メカニズムを通じてテストステロンの産生を刺激することができます[34]。ブラックチョークベリー（アロニア・メラノカルパ）の果実は、ポリフェノールやビタミンC、Eなどの他の抗酸化物質が豊富で、抗炎症作用と抗酸化作用があることが証明されており、肝保護、免疫調節、抗変異原性、抗がん、脂質低下、抗糖尿病、および降圧作用の基礎となっています[35]。最近、ブラックチョークベリーの製品と抽出物は、抗老化特性と老化防止活性に関して真剣な科学的関心を集めています[35,36,37,38,39,40,41,42]。我々は以前、自然老化した健康なウィスターラットの同モデルを用いて、アロニア・メラノカルパ果汁の補給が冠動脈の加齢リモデリングを減少させ、神経保護効果を明らかにし、高齢ラットの認知機能と運動機能を改善することを実証した [41,42]。しかし、文献にはアロニア・メラノカルパベースの抽出物や製品が精巣の老化プロセスに及ぼす影響に関する実験的証拠が不足している。そこで、アロニア・メラノカルパの抗酸化作用と抗炎症作用が精巣の加齢プロセスに影響を与える可能性があるという仮説を立て、本研究の目的を決定した。したがって、本研究の目的は、ポリフェノールが豊富なブラックチョークベリー果汁の補給が、自発的に老化する老齢ラットの精巣の構造的および機能的変化に及ぼす影響を調査することであった。

2. 材料と方法

2.1. アロニア・メラノカルパ果汁の分析と組成

　以前の研究[41]では、健康な自然老化Wistarラットと同じモデル動物と、同じ果汁を使用しました。この研究では、果汁の調製と化学分析について詳細に説明しています。簡単に説明すると、冷凍アロニア・メラノカルパ果実5kgを室温で解凍し、実験室用ミキサーで均質化しました。均質化液を褐色ガラス瓶に移し、60℃の恒温振盪水槽で1時間インキュベートしました。その後、果肉をチーズクロスで濾過し、液体部分を遠心分離して研究に使用しました。総ポリフェノール含有量は、Folin-Ciocalteu試薬を用いて測定しました。ポリフェノールと糖のHPLC分析は、HPLCシステム（Agilent 1220、Agilent Technology、Santa Clara, CA, USA、それぞれUV-Vis検出器と屈折率検出器を使用[41]）で実施しました。 [41]から取得したデータを表1に示します。

表1. アロニア・メラノカルパ果汁のlおよび糖度と組成（[41]より引用）。

2.2. 動物

　詳細な動物実験プロトコルは、Daskalovaら[41]の研究に記載されている。雄Wistarラット（n = 24）は、プロヴディフ医科大学動物飼育室から提供され、標準的な実験室環境（ポリプロピレン製ケージ内、温度22 ± 3 °C、12時間明暗サイクル、相対湿度60 ± 5%に制御された清浄空気環境）下で飼育された。ラットは3群に分けられた。(1) 若齢対照群（CY）— 2ヶ月齢、無補給（n = 8）、(2) 高齢対照群（CO）— 27ヶ月齢、無補給（n = 8）、(3) (A)群— 27ヶ月齢の動物に、アロニア・メラノカルパ果汁（10 mL/kg）を飲料水に1:1の割合で希釈して105日間経口投与（n = 8）。ラットには標準的なげっ歯類用飼料（タンパク質13.45%、炭水化物51.6%、脂肪3.40%を含む）と水道水を自由に摂取させた。1日当たりの果汁投与量は、体重測定（月に2回）後に動物ごとに算出した。A群の動物には、1日当たりの希釈果汁投与量を摂取した後、清水を与えた。実験期間全体を通して、すべての動物が約440 mLの果汁を消費した。実験期間の終了時に、動物を筋肉内ケタミン90 mg/kg/キシラジン10 mg/kgで麻酔し、体重と体長（鼻肛門長と腹囲）を測定し、頸部断頭により安楽死させた。その後、正中陰嚢切開により両側精巣摘出術を実施した。右精巣の重量（絶対重量）を測定し、相対重量（精巣重量（g）/体重（g）×100）を算出した。精巣は10%中性ホルマリンで固定し、固定後パラフィン包埋した。組織学的、免疫組織化学的、形態計測学的、および統計学的解析を実施した。

2.3. HE染色

　通常のヘマトキシリン・エオシン（HE）染色は、標準的な方法に従って以下のように実施した。切片を脱蝋する。アルコール濃度を段階的に上げて水に浸漬し、必要に応じて固定色素を除去する。ミョウバンヘマトキシリンで5分間染色する。切片が「青色」になるまで、流水で5分間よく洗浄する。1%酸性アルコール（70%アルコール中1%塩酸）で5～10秒間分画する。流水で10～15分間よく洗浄する。1%エオシンYで10分間染色する。流水で1～5分間洗浄する。アルコールを用いて脱水し、その後、透明化して封入する。

2.4. 免疫組織化学

　ラット精巣から採取した切片（厚さ5µm）を脱パラフィン処理し、モノクローナル抗体（TRK-C、1:1000（sc-517245）、NTR3、1:100（sc-376561）（Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Heidelberg, Germany））およびポリクローナル抗体（nNOS1、1:100（E-AB-70065）、eNOS3、1:300（E-AB-32268）、MAS1、1:200（E-AB-67951）（Ellabscience Biotechnology Inc.、Houston, TX, USA））を用いて免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のプロトコールは、前報（Daskalova et al.）[42]で詳細に報告している。すべての顕微鏡写真は、Leica DM3000 LED 顕微鏡 (Leica Microsystems、Wetzlar, Germany) と Flexocam C3 デジタルカメラ (Leica Microsystems、Wetzlar, Germany) を組み合わせて撮影されました。

2.5. 形態計測分析

　形態計測分析には、ラットの精巣から採取した厚さ5µmの組織切片を連続的に切片化した。

　定量的形態計測学的研究には、以下の項目が含まれていました。

−精細管上皮の厚さ（μm）

−精細管の平均周囲長（μm）

−精細管の表面積（μm²）

−精細管1本を取り囲む血管の平均数

−精細管内の精原細胞、精母細胞、精細胞の平均数。

　まず、画像アナライザーが自動的に調整され、画像アナライザーによって生成された測定単位 (ピクセル) が実際の測定単位 (μm) に変換されます。

　全ての測定は、動物 1 匹につき 5 枚のスライスと存在する精細管のすべての断面の検査で構成されました。精細管パラメータは、スライスに円形の切り込みを入れ、倍率 ×100 ですべての細管を測定することで確立されました。各細管の精子形成上皮の厚さについて 6 つの異なる場所で測定されました。管の周囲の血管を数え、すでに数えられている血管は他の隣接する管では数えませんでした [5,43,44]。精子形成の定量分析は、円形に切断された精細管上の各タイプの精子形成細胞の核のみを数えることで行いました。各動物から 5 つの切片を、Meistrich ＆ Hess 法 [45] を使用して数えました。測定は、LAS X ソフトウェア (Leica Microsystems、Wetzlar、Germany) を使用して手動で行いました。

2.6. 統計解析

　結果は平均値と標準偏差（SD）で示されている。3つの平均値の比較には、TukeyのHSDを用いた一元配置分散分析（一元配置分散分析）と事後多重比較を用いた。2つの平均値の比較には、独立標本検定を用いた。ノンパラメトリック検定には、Mann–Whitneyの2つの独立標本検定を用いた。尿細管面積と尿細管周囲長と精子形成上皮厚との相関は、ピアソン係数（r）を用いて測定した。p < 0.05を有意とした。統計解析はIBM SPSS Statistics（v25）を用いて実施した。

3. 結果

3.1. 右精巣重量

　実験群間の右精巣重量の比較では、CY群とCO群間（p < 0.05）、およびA群とCY群間（p < 0.05）に有意差が認められた（表2）。これは自然な加齢変化の現れである。

表2.右精巣重量の比較

結果は平均値±標準偏差で表されています。同じ上付き文字で示した値の間には有意差は認められませんでした（p < 0.05）。

CY：若年対照群、CO：高齢対照群、A：アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

3.2. 通常のHE染色

　組織学的データは図1に示す。CY群の標準精巣ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色では、精巣実質は密集した精細管と、わずかな疎性結合組織を含む狭い間質によって構成されていた。精細管の基底膜は微細な層を呈していた。精細管は、大きな核と精原細胞、精母細胞、円形の初期精子、細長い後期精子を含む精子形成細胞によって区別されるセルトリ細胞の重層上皮で構成さており、これらの細胞は基底部から管腔後部にかけてこの順に配列していた。多くの管腔では、管腔内に成熟精子の尾部が存在し、活発な精子形成の兆候が見られた。尿細管間の間質空間にライディッヒ細胞が観察され、多数の血管も伴っていました (図 1)。

図1. ラットの精巣、HE染色、倍率×100/×400。

CY:若年対照群、CO:老年対照群、A:アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

緑色の矢印—細胞の空胞化、オレンジ色の矢印—ライディッヒ細胞、黒色の矢印—成熟精子の尾部（活発な精子形成の兆候）。

　標準ヘマトキシリン・エオシン染色による精巣では、CO群は薄くなった精子形成上皮に顕著な空胞化が認められた。若年対照群と比較して、精子量および精子形成の兆候を示す細管の数が少ないことが顕著であった。細管の基底膜は肥厚し、強い波状を呈していた。間質腔は明らかに拡大していた。ライディッヒ細胞は、随伴する血管数の減少を除いて、目に見える外部変化は認められなかった（図1）。A群では、ヘマトキシリン・エオシン染色で高齢対照群と同様に、細管の基底膜が肥厚し波状を呈していた。精細管では、肉眼的に保存されたセルトリ細胞、精子形成が活発な細管の相対的に多い数、および細管腔内の成熟精子の数が多かった（図1）。精細管では、細胞質が空胞化した細胞も観察された。ライディッヒ細胞に隣接した豊富な血管による豊富な血液供給の存在は印象的でした（図1）。アロニア・メラノカルパ果汁を補給した群では、尿細管がより密に配列しており、尿細管間隙におけるコラーゲン線維の量と分布に変化は見られませんでした。したがって、これは尿細管周囲の血管数の増加と関連している可能性が非常に高いと考えられます。

　表3は、3つの実験群のラットの精細管における精原細胞（Sg）、精母細胞（Sc）、および精子細胞（St）の定量分析データを示しています。データの統計解析では、3つのパラメータすべてにおいて、群間で有意差が認められました。CO vs. CY（p < 0.05）、A vs. CO（p < 0.05）。

表3. アロニア・メラノカルパ果汁の補給による生殖細胞数への影響

結果は平均値±標準偏差で表されている。各列において同じ上付き文字で示された値の間には有意差は認められなかった（p < 0.05）。

CY：若齢対照群、CO：高齢対照群、A：アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

3.3. 精細管の形態計測分析

　湾曲した精細管の構造の形態計測分析結果を図2に示す。

図2. 尿細管形態の形態計測分析。

(A) 尿細管面積（µm²）、(B) 尿細管周囲長（µm）、(C) 精子形成上皮層厚（µm）。

結果は平均値±標準偏差で示す。

CY：若齢対照群、CO：高齢対照群、A：アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

　統計解析の結果、3つの実験群間では、尿細管面積、尿細管周囲長、および精子形成上皮の厚さに有意差は見られませんでした。3つの尿細管形態パラメータの相関解析では、有意な相関は見られませんでした（図3）。

図3. 尿細管の面積および周囲長と精子形成上皮の厚さの相関関係（各グループの症例は次のように色分けされています：CY:青、CO:赤、A:緑）。

　図4は、3つの実験群のラットにおける精細管周囲の血管数の平均を形態計測学的に解析したデータを示しています。この結果は、組織学的所見を決定的に裏付けています。

図4. 尿細管を取り囲む血管の平均数の形態計測学的解析。

結果は平均値±標準偏差として表される。同じ上付き文字で示した値間に有意差は認められなかった（p < 0.05）。

CY：若齢対照群、CO：高齢対照群、A：アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

3.4. 免疫組織化学

3.4.1. TRK-CおよびNT3に対する免疫反応

　図5は、ラット精巣におけるチロシンプロテインキナーゼ受容体-C （TRK-C）および神経栄養因子3（NT3）に対する免疫反応の顕微鏡写真を示す。

図5. ラット精巣。

チロシンプロテインキナーゼ-C（TRK-C）受容体免疫反応、神経栄養因子3（NT3）受容体免疫反応、×400；黄色矢印：ライディッヒ細胞。

CY：若齢対照群、CO：高齢対照群、A：アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

　ライディッヒ細胞におけるチロシンプロテインキナーゼ受容体-Cおよび神経栄養因子3に対する免疫応答の強度を半定量的に解析した結果、CO群ではCY群と比較して低下が見られ、これは加齢に伴う変化の兆候である。アロニア・メラノカルパ果汁を摂取した動物では、CO群と比較してチロシンプロテインキナーゼ受容体-Cおよび神経栄養因子3に対する免疫応答の強度が上昇したことが報告されており、これは精巣ライディッヒ細胞における神経栄養因子の活性上昇の表れである（表4）。

表4.ラット精巣における神経栄養因子3（NT3）受容体およびチロシンプロテインキナーゼ受容体-C（TRK-C）の免疫発現強度。半定量分析。

凡例：- 発現なし、+ 弱い、++ 中程度、+++ 強い発現。

CY:若齢対照群、CO:高齢対照群、A:アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

3.4.2. nNOS、eNOS、およびMAS1免疫反応

　図6は、ラット精巣におけるnNOS、eNOS、およびMAS1（訳者注：：MAS1がん遺伝子（MAS受容体）は、Gタンパク質共役受容体であり、アンジオテンシンIIの代謝産物であるアンジオテンシン（1-7）と結合する）に対する免疫反応の顕微鏡写真である。精細管において、A群では伸長精子細胞および成熟精子におけるnNOS発現率が高く、円形精母細胞におけるnNOS発現率は低かった。CO群では、nNOSは主に成熟精子細胞で観察された。CY群では、伸長精子細胞および成熟精子、ならびに円形精子細胞および未分化精原細胞においてnNOSの発現が増加していた（図6、表5）。間質では、CY、CO、Aの3群すべてにおいて、ライディッヒ細胞および血管内皮においてnNOSの発現が高かった。

図6. ラット精巣nNOS、eNOS、およびMAS1免疫反応、×200。

CY:若年対照群、CO:老年対照群、A:アロニア・メラノカルパ果汁投与群

表5. ラット精巣におけるnNOS、eNOS、MAS1の免疫発現強度。半定量分析。

凡例：- 発現なし、+ 弱い、++ 中程度、+++ 強い発現。

CY:若齢対照群、CO:高齢対照群、A:アロニア・メラノカルパ果汁投与群。

　eNOS の解析では、A 群の精細管の方が CO および CY 群の両者と比較して高い発現レベルを示した。A 群では、eNOS は主に伸長精子細胞および成熟精子で検出され、円形精母細胞ではほとんど観察されなかった。CO 群では、eNOS はすべての精細管細胞（未分化精原細胞、円形精子細胞、伸長精子細胞、成熟精子）に拡散して存在しているが、精原細胞および筋線維芽細胞では明確に観察された。CY 群では、伸長精子細胞および成熟精子細胞での eNOS の発現は乏しかった。間質では、A 群で eNOS の発現がより強く、CO 群および CY 群ではより弱い発現が見られたが、血管の内皮では 3 つの群すべてで観察されなかった（図 6、表 5）。

　CY群におけるMAS1受容体の発現は、精細管の全細胞、ライディッヒ細胞、および間質の血管内皮において高い強度で認められた。A群およびCO群では、両群ともMAS1受容体は円形・細長い精子細胞および成熟精子細胞に認められ、A群でより高い反応強度を示した。間質では、MAS1は主にライディッヒ細胞に認められ、A群およびCO群ともに血管内皮では検出されなかった（図6、表5）。

　図 7 は、A 群の nNOS、eNOS、および MAS1 の免疫反応の強度値が CY 群のものと類似していることを視覚的に示しています。

図7. ラット精巣における nNOS、eNOS、および MAS1 の免疫発現強度の図

4. 考察

4.1. 形態学的変化

　本研究では、生理学的に加齢した動物を生殖老化のモデルとして用いた。この無病モデルにおいて、ブラックチョークベリー果汁の補給はラットの体組織学的および器官測定学的パラメータに有意な影響を与えないことが明らかになった。肉眼レベルでは補給による目に見える変化は認められなかったものの、顕微鏡的データは、尿細管構造の維持、尿細管間腔の縮小、そして豊富な血管に囲まれたライディッヒ細胞の存在を明確に示唆していた。A群の精子形成上皮の厚さは、CY群およびCO群で観察された値とほぼ同等であった。しかし、3つの実験群間の尿細管面積の差は非常に小さかった。高齢対照群と若齢対照群で認められた精巣の組織学的構造における加齢変化は、他の著者らが報告したものと類似している[5,46,47]。サプリメント投与群では、精細管構造が維持されていたという形態学的所見が免疫組織化学的所見と相関していた。ライディッヒ細胞における神経栄養因子の濃度上昇は、細胞の機能活性の上昇とそれに伴うテストステロン産生レベルの増加と相関していた。テストステロンは精子形成を強力に刺激する。サプリメント投与群のライディッヒ細胞の機能活性上昇のもう一つの兆候は、細胞近傍に見られる血管の多さである。これらの肉眼解剖学的データは、ラットの精巣重量の変化が加齢とともに正常に起こることを示し、これは他の研究者らによっても報告されている[5,46,48]。 4.2. TRK-CおよびNT3免疫反応神経栄養因子によるライディッヒ細胞の機能活性については、既に文献で十分に説明されている[49]。神経栄養因子は、体細胞のセルトリ細胞とライディッヒ細胞、そして精子形成上皮の両方に影響を及ぼす。その調節作用は胚発生期に始まり、雄個体の生涯を通じて生殖を制御し続ける[50]。いくつかの研究では、神経成長因子（NGF）や神経栄養因子3（NT3）などの特定の神経成長因子の効果が、成体ライディッヒ細胞の発達に重要である可能性が示唆されている[50]。神経栄養因子3は、チロシンタンパク質キナーゼTRKファミリーのメンバーであるTRK-C受容体に結合し、抗アポトーシス作用を示す[50]。出生前において、神経栄養因子3は精索形成と生殖細胞の分化の制御、そして男性の性別決定に関与している。神経栄養因子3は、胚発生期に精巣のセルトリ細胞から分泌される[51]。神経栄養因子3プロモーターにはセルトリ細胞転写因子SOX9の結合部位が含まれており、SOX9はライディッヒ細胞の発達を制御する神経栄養因子3の発現を刺激する[52]。

　結果は、CO群ではCY群と比較してチロシンタンパク質キナーゼ-Cおよび神経栄養因子3受容体の免疫反応の強度が低下していることを示しており、これは精巣における加齢変化の表れです。サプリメント摂取の影響下では、チロシンタンパク質キナーゼ-Cおよび神経栄養因子3受容体の免疫反応の強度が上昇していることが分かりました。これは、ライディッヒ細胞の刺激と機能活性の上昇の表れである可能性があります。これはまた、テストステロン分泌の増幅にもつながる可能性があります。ライディッヒ細胞周辺における血管数の増加は、ライディッヒ細胞の活性上昇のもう一つの兆候であり、精巣の栄養状態の改善の兆候でもあります。

　近年、加齢による酸化ストレス下では神経栄養因子が酸化修飾を受け、その効果が低下することが明らかになっている[53]。その一方で、ポリフェノールは脳由来神経栄養因子（BDNF）、神経成長因子（NGF）、神経栄養因子3（NT3）、神経栄養因子4（NT4）などの神経栄養因子の合成を促進するほか、チロシンタンパク質キナーゼ-C受容体への直接結合能を高め、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）/プロテインキナーゼB（AKT）、ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、シグナル伝達・転写活性化因子3（STAT3）、活性化cAMP応答配列結合タンパク質（CREB）などの経路を介して転写、翻訳、増殖、成長、生存を調節するというエビデンスもある[54]。食事性ポリフェノールが精巣の神経栄養因子に及ぼす影響については、文献にデータが不足している。機能性食品がこれらの因子に及ぼす影響に関する報告は、主に脳の構造と機能に焦点を当てています[55,56,57,58,59,60,61,62,63]。

4.2. TRK-CおよびNT3免疫反応

　神経栄養因子によるライディッヒ細胞の機能活性については、既に文献で十分に説明されている[49]。神経栄養因子は、体細胞のセルトリ細胞とライディッヒ細胞、そして精子形成上皮の両方に影響を及ぼす。その調節作用は胚発生期に始まり、雄個体の生涯を通じて生殖を制御し続ける[50]。いくつかの研究では、神経成長因子（NGF）や神経栄養因子3（NT3）などの特定の神経成長因子の効果が、成体ライディッヒ細胞の発達に重要である可能性が示唆されている[50]。神経栄養因子3は、チロシンタンパク質キナーゼTRKファミリーのメンバーであるTRK-C受容体に結合し、抗アポトーシス作用を示す[50]。出生前において、神経栄養因子3は精索形成と生殖細胞の分化の制御、そして男性の性別決定に関与している。神経栄養因子3は、胚発生期に精巣のセルトリ細胞から分泌される[51]。神経栄養因子3プロモーターにはセルトリ細胞転写因子SOX9の結合部位が含まれており、SOX9はライディッヒ細胞の発達を制御する神経栄養因子3の発現を刺激する[52]。

4.3. nNOS、eNOS、およびMas1免疫反応

　3種類の一酸化窒素合成酵素アイソフォームはすべて精巣に存在し、それぞれ異なる細胞分布パターンを示すものの、重複するパターンを示す。nNOS、iNOS、およびeNOSは、精巣上皮のセルトリ細胞と生殖細胞の両方に局在する[64,65,66,67]。また、ライディッヒ細胞[68]、筋様細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、および精子[64,65,67]にも存在する。一酸化窒素合成酵素（NOS）は精巣のあらゆる種類の細胞に存在することから、一酸化窒素（NO）/一酸化窒素合成酵素（NOS）は精子形成に必要であることが示唆される。本研究では、CO群ではCY群と比較して、ライディッヒ細胞および精子形成上皮におけるnNOSおよびeNOSに対する免疫反応の強度が加齢とともに低下し始めることが示された。 A群では、ライディッヒ細胞および精子形成上皮におけるnNOSおよびeNOSに対する免疫反応の強度が増加し、若年対照群の強度に近づきました。これは、加齢に伴う酸化ストレスの増加に対する防御反応として、一酸化窒素合成プロセスが活性化されたことの兆候と考えられます。最近まで、一酸化窒素合成酵素がどのように制御されているかは明らかではありませんでした。精巣における一酸化窒素合成酵素を制御することが知られている分子としては、ホルモンとサイトカインの2種類があります。

　eNOSとiNOSの発現レベルは、正常時と病的状態において変動します。これら2つのアイソフォームの過剰発現は、精子の運動性および生存率の低下、生殖細胞におけるアポトーシスの活性化、そして文字通り精子形成の阻害など、生殖組織における破壊的なプロセスを引き起こす可能性があります。病的プロセスと生理的プロセスのいずれにおいても、一酸化窒素の逆説的な機能は、体全体の状態と酸化／抗酸化バランスのメカニズムに依存しています[28]。

　ヒト生殖器官には、アンジオテンシンIIおよびアンジオテンシン(1-7)を含む様々なレニン・アンジオテンシン系（RAS）ファミリーメンバーが見出されており、アンジオテンシンIIサブタイプ2受容体(AT1R)、アンジオテンシンIIサブタイプ2受容体(AT2R)、そしてプロトオンコゲンMas受容体の発現も確認されています。これらの構成要素は、成熟、生殖調節の微調整、血管新生、腫瘍細胞の増殖など、レニン・アンジオテンシン系の生理学的および病理学的プロセスに対する局所的影響を媒介するために不可欠です[22,68,69]。

　アンジオテンシン変換酵素2は主要なアンジオテンシン-(1-7)形成酵素であり、アンジオテンシンIIからアンジオテンシン-(1-7)を生成することができる[70]か、または効率は低いが、アンジオテンシンIをアンジオテンシン-(1-9)に加水分解することによってアンジオテンシン-(1-7)を生成することができる[71]。その後、アンジオテンシン変換酵素および中性エンドペプチダーゼによる加水分解によりアンジオテンシン-(1-7)が生成される[72]。アンジオテンシン-(1-7)は、Gタンパク質共役型Mas受容体の内因性リガンドとして作用することが確立されている[73,74]。この細胞表面受容体は、脳、心臓、腎臓、内皮、および精巣で高度に発現している[74]。アンジオテンシン変換酵素2の発現パターンと同様に、精巣のMas mRNAはライディッヒ細胞とセルトリ細胞に見られ、ライディッヒ細胞での発現はさらに高い[73]。さらに、Masノックアウトマウスの最近の研究では、Masの欠失がライディッヒ細胞におけるテストステロン生合成に関与する酵素（ステロイド生成急性調節タンパク質および3β-ヒドロキシステロイド脱水素酵素1および6）の発現に影響を及ぼすことがわかり、男性生殖器系におけるアンドロゲン代謝の調節においてMasが役割を果たしている可能性が示唆されている[74]。

4.4. ライディッヒ細胞の抗酸化物質とステロイド生成機能

　Zhaoらは最近、酸化ストレスと慢性炎症が、生体内および生体外の両方で、老化したライディッヒ細胞におけるテストステロン産生の低下に関与していることを明らかにした。彼らの結果は、活性化B細胞核因子κ軽鎖エンハンサー（NF-κB）とp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（p38 MAPK）という2つのシグナル伝達経路の活性化がシクロオキシゲナーゼ2（COX2）阻害剤の発現を上昇させ、老化において一般的に観察される酸化ストレス反応および慢性炎症と機能的に関連していることを示す証拠を示し、加齢に伴うテストステロン合成低下の制御におけるシクロオキシゲナーゼ2阻害剤の重要性を強調している[75]。精巣における活性酸素種の加齢に伴う蓄積は、精液の質の低下の主な原因の一つであることが示されている[7,11,76]。

　ライディッヒ細胞はステロイド生成と精子形成に必須である。ライディッヒ細胞は黄体形成ホルモン受容体（LH-R）であるシトクロムP450を発現し、アンドロステロンを分泌する[77]。ステロイド生成過程は基底状態で活性酸素種を生成するため、活性酸素種障害の影響を非常に受けやすい。さらに、活性酸素種作用は、ステロイド生成過程がシトクロムP450酵素によって調節される部位で起こる[78]。一方、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、精巣精子形成細胞および体細胞は、基底状態および炎症状態において、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子（TNF）など、いくつかの免疫調節性および炎症性サイトカインを産生する[79]。これらの発現増加は、炎症につながる活性酸素種、特にH₂O₂の産生を刺激し、ライディッヒ細胞を酸化ストレスにさらす[80]。ライディッヒ細胞は細胞内抗酸化防御システムを有し、活性酸素種と抗酸化物質のバランスを維持することで細胞損傷を防ぎます[81]。しかし、ライディッヒ細胞の修復機構が広範囲の酸化損傷によって損なわれると、細胞はプログラム細胞死を起こし、ライディッヒ細胞数の減少とテストステロン産生不足を引き起こします[82]。

　活性酸素種と炎症性サイトカインは密接に関連しており、循環を維持しています。活性酸素種は熱ショックタンパク質を誘導し、これが炎症性サイトカインと細胞接着分子（CAM）の発現を刺激します[83]。これらの結果は、白血球や常在細胞（例：マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞）などの活性酸素種産生白血球（WBC）の刺激につながります[84]。活性酸素種の過剰産生または内因性抗酸化酵素の過剰消費に起因する活性酸素種の蓄積は、主に細胞機能障害、DNA損傷、ミトコンドリア損傷、脂質過酸化、細胞アポトーシスなどの損傷特性と関連しています[85]。

　本研究は、これまで十分に研究されてこなかった分野に光を当てるものです。そのため、本稿では、アロニア・メラノカルパ果汁に含まれる食物ポリフェノール、すなわちアントシアニン、ケルセチン、カテキン、クロロゲン酸などについてのみ考察します。表1に示すように、果汁は特にフェノール化合物が豊富で、その累積含有量は11,000 mg/Lを超えています。クロロゲン酸とネオクロロゲン酸に代表されるヒドロキシケイ皮酸が主要なフェノール化合物であり、次いでアントシアニン（シアニジン-3-ガラクトシド、シアニジン-3-グルコシド、シアニジン-3-アラビノシド、シアニジン-3-キシロシド）が挙げられます。植物性フラボノイドは、がん予防、心血管疾患および神経変性疾患のリスク低減、老化に伴う症状の遅延など、多くの健康効果と関連付けられています[40]。フラボノイドはコレステロールや他のステロイドと化学構造が類似しており、ライディッヒ細胞におけるアンドロゲン産生に影響を与える可能性があります。そのため、1960年代初頭以降、500以上の出版物で、さまざまなフラボノイドがテストステロン産生に及ぼす影響が報告されています。しかし、ステロイド合成に対するフラボノイドの影響の分子メカニズムが部分的に解明されたのはごく最近のことです[40]。加齢は、成体ライディッヒ細胞におけるステロイド生成急性調節タンパク質（StAR）レベルの低下と関連しており、ミトコンドリアへのコレステロールの輸入が不完全になり、テストステロン産生が低下します。加齢に伴うテストステロン産生の低下は、フラボノイドまたはその誘導体の補給によりステロイド生成急性調節タンパク質やシトクロムP450ファミリー11サブファミリーAメンバー1（Cyp11a1）遺伝子の発現を増加させることで遅らせることができます[86,87]。

　Huらの研究結果によると、研究対象となった4種類のアントシアニンはすべて、活性酸素種の生成を阻害し、ミトコンドリア膜の潜在的な損傷を軽減し、テストステロン産生の増加に寄与することが証明されています。中でも、ジグリコシドを含むシアニジン-3,5-ジグルコシドは、抗酸化能の点で最も優れており、細胞機能不全を改善し、ステロイド生成急性調節タンパク質の発現を増加させます[88]。

　Martinらは、フラボノイドとイソフラボノイドの使用による精巣ステロイド生成の促進について詳細に議論した[34]。Kingらは、アロニア・メラノカルパ果汁に存在する活性成分であるケルセチン、カテキン、アントシアニンなどのポリフェノールがライディッヒ細胞でのステロイド生成にプラスの影響を与えることを発見した。CAMP応答性エレメント結合タンパク質1（Creb1）は、ライディッヒ細胞でステロイド生成急性調節タンパク質を含むステロイド生成遺伝子の発現の重要な活性化因子である[89]。Cormierらは、ケルセチンがCreb1の転写活性とCyp11a1および遺伝子フェレドキシン 1（Fdx1）（訳者注：フェレドキシン（Ferredoxin）は、鉄と硫黄を含む「鉄-硫黄クラスター（Fe-Sクラスター）」を持つ、電子伝達を担う小さなタンパク質で、光合成や窒素固定など多くの重要な代謝反応で電子の運び屋として機能します）のプロモーター活性を増強することにより、ステロイド生成にプラスの効果を発揮することを報告した[90]。他の研究者らは、ケルセチンがMA-10ライディッヒ細胞におけるステロイド生成急性調節タンパク質mRNAレベル、ステロイド生成急性調節タンパク質プロモーター活性、およびステロイドホルモン産生を増加させることを報告している[91]。Wangによれば、ライディッヒ細胞におけるステロイド生成急性調節タンパク質発現とステロイド生成は、ケルセチンに応答する性決定遺伝子Y-box 2（Sox2）シグナル伝達を阻害することによっても促進される[92]。

　老化の特徴の 1 つは、老化関連分泌表現型 (SASP) と呼ばれるさまざまな生理活性因子を分泌する老化細胞の増加であり、ケルセチンは老化細胞を標的とする第一世代の老化阻害剤の 1 つです [93]。さらに、Yu らは、雄ラットにカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンガレートを投与してから 8 時間後に血漿テストステロン値が上昇したと報告しています [94]。化学組成データから明らかなように、ブラックチョークベリー果汁は特にアントシアニンが豊富です。これらのフラボノイドは、テストステロン産生を調節する可能性という点では特に研究されていませんが、ライディッヒ細胞でシクロオキシゲナーゼ2活性を阻害し、MAPK 経路の活性を調整できることが知られているため、ステロイド生成を促進する可能性があります。どちらのメカニズムもライディッヒ細胞でのステロイド生成急性調節タンパク質発現に影響します [95,96]。

5. 結論

　本研究のデータは、ポリフェノールを豊富に含むブラックチョークベリー果汁の補給がラットの精巣の老化プロセスを遅らせることを初めて実証しました。この介入は、精巣環境の抗酸化ポテンシャルを高めると同時に、ライディッヒ細胞の機能活性を高めることが観察されました。湾曲した精細管の健全性の維持と血管数の増加、そして精巣環境における神経栄養因子と抗酸化分子の存在量の増加は、アロニア・メラノカルパ果汁の抗老化効果の具体的な証拠となります。アロニア・メラノカルパ果汁は、その強力な抗酸化作用により、抗老化剤としての活用が期待されています。機能性食品の可能性を活用することで、この果実の用途は精巣機能の強化にとどまらず、より広範な健康効果へと広がります。この包括的なアプローチは、精巣の健康状態を増進するだけでなく、男性の健康と生活の質の全体的な向上にも貢献します。本研究には、精子パラメータとアポトーシスマーカーを調査していないという限界があることに留意すべきである。しかしながら、これはより具体的な分析を伴う更なる詳細な研究の基礎となり得る信頼性の高い情報を提供する初期研究である。

参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください）

　この文献は、Curr Issues Mol Biol. 2024 May 8;46(5):4452–4470.に掲載されたBlack Chokeberry (Aronia melanocarpa) Juice Supplementation Improves Oxidative Stress and Aging Markers in Testis of Aged Rats.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。

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