ケフィアライフをお勧めする中垣技術士事務所
| 文献調査（発酵乳、腸内細菌の科学：研究の最前線） |
神経保護作用が期待される、Lactobacillus delbrueckii株とナツメ種子粉末を配合した 新規機能性発酵乳の開発およびゲノム解析による評価 |
Amel A Ibrahim et al., |
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| 要約 |
本研究は、食品への応用を目的として、神経保護作用を持つ可能性のある乳酸菌（LAB）を分離・選抜することを目的とした。15菌株を対象に、プロバイオティクスとしての特性、γ-アミノ酪酸（GABA）産生能、およびアセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害活性についてスクリーニングを行った。その結果、Lactobacillus delbrueckii AY8株およびAY15株が、プロバイオティクスとしての高い可能性、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性、およびγ-アミノ酪酸産生能を示した。全ゲノム解析により、これらのプロバイオティクス特性や神経保護特性に関連する遺伝子が確認された。食品マトリックス中での機能を評価するため、ナツメ種子粉末（JP）を添加または無添加の乳に、これら菌株を補助的スターターとして用いて発酵を行った。ナツメ種子粉末を添加した乳でAY8株を用いて発酵させた場合、生理活性物質が有意に増加し、総フェノール含量（235.75 mg GAE/g）やフラボノイド含量（114.07 mg RE/g）が高まるとともに、優れた抗酸化活性（110.24 mg アスコルビン酸当量/100 g）が認められた。この生物学的変換によりアセチルコリンエステラーゼ阻害活性が著しく向上し、AY8株による発酵サンプルでは30.66%の阻害率を達成した。これは、ナツメ種子粉末のみの対照区（18.27%）やプレーンの対照区（12.30%）と比較して有意に高い値であった。また、この組み合わせは製品の粘度や官能特性の向上にも寄与した。本研究は、新規なL. delbrueckii株の発見に成功したことを示すものである。これらの菌株を植物性サプリメントと組み合わせて食品モデルに適用することで、神経保護作用が強化された機能性食品を創出できることが示され、食品の機能性における微生物代謝の重要性が強調された。 |
| 目次(クリックして記事にアクセスできます） |
| 1. はじめに |
| 2. 材料および方法 |
| 2.1. 乳酸菌の分離およびアセチルコリンエステラーゼ阻害能のスクリーニング |
| 2.2. プロバイオティクスとしての可能性および安全性特性 |
| 2.2.1. 酸、ペプシン、およびパンクレアチンに対する耐性の評価 |
| 2.2.2. 胆汁酸塩耐性 |
| 2.2.3. 消化管病原菌に対する抗菌活性 |
| 2.2.4. γ-アミノ酪酸（GABA）産生遺伝子の検出 |
| 2.2.5. 溶血活性 |
| 2.2.6. 抗菌薬感受性試験（AST） |
| 2.3. 16S rRNAを用いた分子生物学的同定 |
| 2.4. AY8株およびAY15株の遺伝子型解析 |
| 2.4.1. ゲノムDNAの抽出 |
| 2.4.2. 全ゲノムシーケンシング |
| 2.4.3. バイオインフォマティクス解析 |
| 2.5. 機能性発酵乳の製造における選抜菌株の補助的スターターとしての利用 |
| 2.5.1. スターターの調製 |
| 2.5.2. 理化学的分析 |
| 2.5.3. 機能性発酵乳の粘度および官能評価 |
| 2.5.4. 乳酸菌の生存性 |
| 2.5.5. 生理活性化合物および抗酸化活性 |
| 2.5.5.1抗酸化活性 |
| 2.5.5.2.アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害 |
| 2.6. 統計解析 |
| 3. 結果と考察 |
| 3.1. 乳酸菌株によるアセチルコリンエステラーゼ阻害作用 |
| 3.2. プロバイオティクスとしての潜在的特性 |
| 3.3. 抗菌活性 |
| 3.4. グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）遺伝子の検出 |
| 3.5. 溶血活性および薬剤感受性試験（AST） |
| 3.6. 分子生物学的同定 |
| 3.7. AY8およびAY15のゲノム特性 |
| 3.7.1. プロバイオティクス関連遺伝子の特定 |
| 3.7.2. アセチルコリンエステラーゼ阻害に関与する遺伝子の特定 |
| 3.8. 発酵乳に対する選定菌株およびナツメ種子粉末の影響 |
| 3.8.1. 理化学的特性 |
| 3.8.2. 粘度および官能評価 |
| 3.9. プレバイオティクスとしてのナツメ種子粉末の効果 |
| 3.10. 発酵乳の神経保護作用の可能性に関する評価 |
| 4. 結論 |
本文 |
| 1.はじめに |
| 神経変性疾患、とりわけ認知症の世界的な増加は、重大な社会経済的および医療上の課題となっています[1]。この状況は、人口の高齢化や根本的な治療法の欠如によってさらに深刻化しています[2]。認知症は世界の死因の第7位を占め、現在5,700万人以上が罹患しており、年間1,000万人の新規症例が報告されています。また、2050年にはその患者数が1億5,200万人を超えると予測されています[3]。アルツハイマー病やパーキンソン病といった疾患の病態形成は、本質的に多因子的なものであり、酸化ストレス[4]、神経炎症[5]、アセチルコリンエステラーゼ活性などの酵素機能の調節不全[6]、および脳-腸軸の破綻[7]によって引き起こされます。 |
| こうした状況を受け、天然物（天然由来成分）を活用した革新的な戦略の確立が急務となっています。プロバイオティクスは、神経変性疾患に対する有望な治療薬として注目されています[8]。特にLactobacillus delbrueckiiなどの特定の菌株は、強力な抗酸化作用、抗菌作用、および抗炎症作用を示すことが明らかになっています[9]。その神経保護作用は、酸化ストレスの軽減、認知機能の安定に不可欠な抑制性神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸の産生[10]、さらには記憶や学習に重要なアセチルコリンのレベルを維持するためのアセチルコリンエステラーゼ阻害能[11]によって裏付けられています。さらに、L. delbrueckiiなどの乳酸菌株が産生する細胞外多糖（EPS）は、抗炎症作用や免疫調節作用を示し、MAPK/NF-κBシグナル伝達経路の調節を介して神経細胞を保護します[12]。これらの作用が発揮される上で、腸-脳軸が重要な経路としての役割を果たしています[13]。 |
| 同時に、植物由来の生理活性物質は、神経保護に対する補完的なアプローチを提供します。中国において、ナツメ（Ziziphus Jujuba Mill.）の種子は、年間生産量が300万トンを超える主要な農業副産物でありながら、十分に活用されていない資源となっています[14]。従来は食用に適さないとされてきましたが[15]、ナツメの種子にはフラボノイド、アルカロイド、多糖類といった生理活性化合物が豊富に含まれています[16]。これらの化合物は、抗酸化作用、抗炎症作用、抗菌作用を示すことが報告されており、生体内（in vivo）において顕著な神経保護作用や抗不眠作用をもたらします。実際、6′″-フェルロイルスピノシン（6′″-feruloylspinosin）などの成分において、こうした作用が確認されています[16]。 |
| したがって、強力な生理活性特性で知られるナツメ種子粉末と、本来的に神経保護作用を有する特定の乳酸菌株を組み合わせることは、機能性食品開発における有望かつ革新的な戦略となります。本研究では、新規機能性発酵乳の補助スターターとして利用するため、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性、γ-アミノ酪酸産生能、およびプロバイオティクス特性に基づいて、伝統的な乳酸菌株を選抜することを目的としました。製品の機能性を高めるためのプレバイオティクス素材としてナツメ種子粉末が活用され、その新規配合物について、神経保護作用の可能性を評価するin vitro試験が行われました。 |
| 2. 材料および方法 |
| 2.1. 乳酸菌の分離およびアセチルコリンエステラーゼ阻害能のスクリーニング |
| 伝統的な発酵乳製品のサンプル25点を採取し、4℃で保存した（表S1）。菌の分離にあたっては、各サンプルを脱脂乳中で30℃、37℃、および42℃にて凝固するまで培養した。その後、サンプルを乳酸球菌用M17寒天培地（Baidei社、中国・山南）および乳酸桿菌用MRS寒天培地（Aobox biotechnology社、中国・北京）に画線塗抹し、ガスパックシステム（Anaeropack-MicroAero、日本・新潟）を用いて、それぞれの温度で嫌気培養を行った。得られた分離株については、表現型による評価を行い、その後の解析に備えて-80℃で保存した[17]。 |
| 48時間培養物から得られた無菌の無細胞ろ液（CFF）は、遠心分離（10,000×g、10分、4℃）を行い、続いて中和および無菌の0.22 µmメンブレンフィルターによるろ過を行うことで調製した。無細胞ろ液のアセチルコリンエステラーゼ阻害（AChEI）活性は、マイクロプレートアッセイ法 [18] を用いて測定した。陽性対照として、塩酸ドネペジル（DRS；Shanghai Aladdin Biochemical Technology、中国・上海）および臭化水素酸ガランタミン（GRS；Macklin、中国・上海）を使用した。すべての実験は3連（triplicate）で行い、3回繰り返した。アセチルコリンエステラーゼ阻害率は、以下の式を用いて算出した。 |
アセチルコリンエステラーゼ阻害率（％） ＝[(ブランクOD)－サンプルOD]/ブランクOD]×100 |
| 標準品のアセチルコリンエステラーゼ%を算出する場合のブランクはリン酸緩衝生理食塩水（PBS; 50 mM）であるのに対し、無細胞ろ液のアセチルコリンエステラーゼ%を算出する場合のブランクは培養培地（MRSまたはM17）である。 |
| 実験は3連（n = 3）で行い、結果は阻害率の平均値 ± 標準偏差として示した。 |
| 2.2. プロバイオティクスとしての可能性および安全性特性 |
| アセチルコリンエステラーゼ阻害能を示した15株の乳酸菌分離株について、プロバイオティクスとしての機能的特性を評価した。 |
| 2.2.1. 酸、ペプシン、およびパンクレアチンに対する耐性の評価 |
| 胃内および腸内環境に対する耐性は、Madianら[19]の方法に従って評価した。簡潔に述べると、一晩培養した菌体を遠心分離（5000×g、10分間、4℃）により回収し、PBSで2回洗浄した後、最終濃度が約10⁹ CFU/mLとなるように人工胃液に再懸濁した。この人工胃液は、pH 3.0のPBSにペプシン（Shanghai Aladdin社製、中国・上海）を1:10,000の濃度で添加したものを用いた。胃内環境を模した段階では、懸濁液を37℃で0時間および3時間インキュベートした。続いて腸内環境を模した段階として、培養液1 mLを人工腸液（pH 8.0、1 mg/mLのパンクレアチンを含む）9 mLに移し、37℃で0時間および4時間インキュベートした。生物学的対照（biotic control）としては、各菌株を最適条件下で最適培地に接種したものを用いた。非生物学的対照（abiotic control）としては、菌を接種していない滅菌人工胃液を用いた。各分離株について、それぞれの対照に対するストレス下での生存率（SR）を以下の式で算出した： |
生存率（％） ＝[最終log10CFUml-1(ストレス下)／初期log10CFUml-1(生物学的対照)]×100 |
| 分離株の耐酸性は、その生存率に基づき、感受性（10%未満）、中程度の耐性（10～60%）、良好な耐性（60～80%）、および非常に良好な耐性（80%超）の4つのグループに分類された [20]。 |
| 2.2.2. 胆汁酸塩耐性 |
| 胆汁酸塩耐性は、Guoら[21]の方法に従って評価した。一晩培養した菌液を、0.3% (w/v)の胆汁酸塩を添加したMRSブイヨンおよび無添加のMRSブイヨンに接種した。0.3%胆汁酸塩を含むMRSブイヨンおよび含まないMRSブイヨン（いずれも菌を接種していないもの）を非生物的対照（アビオティック・コントロール）とし、分光光度計のブランク（対照）として使用した。これらの培養液を37℃で培養し、分光光度計（Jinghua社製、中国）を用いてOD600における吸光度を1時間ごとに24時間まで測定することで増殖を記録した。その際、未接種の培地をブランクとして使用した。胆汁酸塩存在下での生存率に基づき、分離株をChateauら[22]に従って4つのグループに分類した。 |
| 2.2.3. 消化管病原菌に対する抗菌活性 |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC33110およびEscherichia coliNCTC12900に対する抗菌活性を、寒天ウェル拡散法を用いてin vitroで評価した。各病原菌（10⁹ CFU/mL）をそれぞれの培地に接種し、直径6 mmのウェルを形成させた。各ウェルに滅菌・中和処理を施したCFS（nCFS）を100 µL添加し、37℃で24時間培養した。陽性対照としてアンピシリン（10 mg/mL）を、陰性対照として未接種のMRSブイヨンを用いた。阻止円の平均直径をミリメートル（mm）単位で測定した。 |
| 2.2.4. γ-アミノ酪酸（GABA）産生遺伝子の検出 |
| 対数増殖期の細菌培養液から、TIANamp Bacteria DNA Kit（Tiangen Biotech、中国・北京）を用いて全DNAを抽出した。gad遺伝子の有無は、Direct PLABCR kit（Sangon Biotechnology、中国・上海）および特異的プライマー（gad-F/gad-R、Sangon Biotechnology、中国・上海）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により評価した。反応はBio-Rad社のサーマルサイクラーを用いて行い、得られた増幅産物は1% (w/v) アガロースゲル電気泳動により解析した。対照として、L. plantarumS WU-ZFT6（陽性）およびL. rhamnosus DSM 20021（陰性）を用いた。PCRのプロトコルは、Langaら[23]が記載した条件に従った。 |
| 2.2.5. 溶血活性 |
| 分離された乳酸菌株の溶血活性を測定し、実用化に向けた安全性を評価した [24]。各菌株を、7% (v/v) の脱繊維ヒツジ血液を添加した血液寒天培地に画線塗抹した。その後、培地を37℃、微好気条件下で48時間培養した。培養終了後、溶血の有無を観察した。 |
| 2.2.6. 抗菌薬感受性試験（AST） |
| 乳酸菌（LAB）株の抗菌薬感受性は、ディスク拡散法を用いて測定した。使用した抗菌薬ディスクは、アンピシリン（10 µg）、セフトリアキソン（30 µg）、テトラサイクリン（30 µg）、ゲンタマイシン（10 µg）、ペニシリン（10 U）、エリスロマイシン（15 µg）、シプロフロキサシン（5 µg）、クロラムフェニコール（30 µg）、リンコミシン（2 µg）、およびスルファメトキサゾール（25 µg）の10種類である。プレートは最適な条件下で24時間培養した。阻止円の直径をmm単位で測定し、CLSIガイドライン [25] に基づいて、感受性（S）、中等度感受性（I）、または耐性（R）に分類した。 |
| 2.3. 16S rRNAを用いた分子生物学的同定 |
| 分離された乳酸菌の分子生物学的同定は、16S rRNA遺伝子の塩基配列解析により行った。精製ゲノムDNAを鋳型とし、特異的プライマーである27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）および1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）を用いて16S rRNA遺伝子を増幅させた。得られた増幅産物について塩基配列を決定し、その配列の相同性を、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースのBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて解析した。 |
| 2.4. AY8株およびAY15株の遺伝子型解析 |
| 2.4.1. ゲノムDNAの抽出 |
| 細菌株AY8およびAY15をMRS液体培地に接種し、37℃、150 rpmの条件下で約12時間培養した。遠心分離（10分間、12,000× g）により菌体を回収し、メーカーのプロトコルに従って、Bacterial/Fungal DNA extraction kit（Magnetic Beads、Changzhou、中国）を用いてゲノムDNAを抽出した。 |
| 2.4.2. 全ゲノムシーケンシング |
| ゲノムシーケンシングは、PacBioおよびIlluminaのシーケンシングプラットフォームを組み合わせて外部委託により実施した。Illuminaシーケンシングについては、各菌株のゲノムDNAを用いてシーケンシングライブラリを構築した。断片化したDNA断片から、Nextera XT Library Prep Kit（Illumina社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてIlluminaシーケンシングライブラリを調製した。調製したライブラリは、Illumina NovaSeq 6000プラットフォーム（Illumina社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いたペアエンドシーケンシング（2 × 150 bp）に供した。PacBioシーケンシングについては、ゲノムDNAの断片化、精製、末端修復を行い、SMRTbellシーケンシングアダプター（Pacific Biosciences社、米国カリフォルニア州メンローパーク）をライゲーションした。続いて、標準的な手法に従ってPacBioライブラリを調製し、1つのSMRTセルを用いてシーケンシングを行った。 |
| 2.4.3. バイオインフォマティクス解析 |
| PacBioおよびIlluminaプラットフォームから得られたデータを用いて、バイオインフォマティクス解析を行った。解析には、Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology社のオンラインプラットフォームであるMajorbio Cloud Platformを使用した。ショートリードおよびHiFiリードをUnicycler (V0.4.8) [26]およびPilon (V1.22)を用いてアセンブルし、完全なゲノムを構築した。染色体およびプラスミドのコード領域は、それぞれGlimmerまたはProdigal (V2.6.3) [27]およびGeneMarkS [28]を用いて予測した。 |
| 2.5. 機能性発酵乳の製造における選抜菌株の補助的スターターとしての利用 |
| 2.5.1. スターターの調製 |
| 補助的スターターとして用いる菌株（AY8およびAY15）は、3回の連続継代培養によって活性化させた。その後、接種した乳を42℃で18時間培養し、最終菌数を約2×10⁸ CFU/mLに調整した。この目標菌数は、機能性食品に推奨されるプロバイオティクスの最低生菌数（10⁶～10⁷ CFU/mL）を上回るとともに、代謝産物の生成に十分な菌量を確保できることから選定されたものである[29]。 |
| ヨーグルト製造用の基材は、全脂粉乳（Yili社製、中国）を水に溶解・復元して調製した。メーカーのデータによれば、この粉末の成分（乾物ベース）は、タンパク質25%、脂肪28%、炭水化物42%であった。復元した乳基材の最終的な組成はAOAC法[30]を用いて分析・決定され、その結果は、全固形分12.0%、タンパク質2.76%、脂肪3.11%、炭水化物4.6%であった。この標準化された基材を、その後のすべてのヨーグルト調製に使用した。続いて、復元乳を2つの主要なバッチに分けた。一方のバッチには、ナツメ種子粉末（JP）（Nanjing Tongrentang Health Industry社製、中国；組成：全固形分97.5%、タンパク質1.12%、脂肪4.06%）を2%（w/v）添加した。もう一方のバッチはJPを添加せず、対照（コントロール）とした。両バッチとも、その後90℃で5分間の加熱処理を行った[31]。加熱処理後、乳を発酵温度である42℃まで冷却した。各主要バッチ（JP添加および無添加）をさらに4つの処理条件に細分化し、合計8つの実験群を作成した。C1：市販のヨーグルトスターター（Lactobacillus Yogurt starter、Beijing Chuanxiu Technology社製、中国）を直接接種し、pH 4.70 ± 0.1で凝固するまで42℃で培養した。T1：市販スターターを添加する前に、菌株AY8で予備発酵（42℃、1時間）を行った。T2：市販スターターを添加する前に、菌株AY15で予備発酵（42℃、1時間）を行った。T3：市販スターターを添加する前に、菌株AY8とAY15の混合物で予備発酵（42℃、1時間）を行った。サンプルC2、T4、T5、およびT6は、JPの有無を除き、同一の条件で処理された。目標とするpH（4.70 ± 0.1）に達した時点で発酵を終了させた。得られた発酵乳を穏やかに撹拌し、砂糖を5%添加して冷却した後、その後の分析に供するために4.0 ± 0.5 °Cで14日間保存した。 |
| 2.5.2. 理化学的分析 |
| 冷蔵保存期間中、機能性発酵乳の理化学的特性を分析した。pHはpH計（PHS-3E、Shanghai Instrument & Electronics Scientific Instruments Co., Ltd.、中国・上海）を用いて測定した。滴定酸度（乳酸％として表示）、固形分（％）、および全窒素含量は、AOAC法[30]に基づきケルダール法を用いて分析した。脂肪含量は、フィルターバッグ法（ANKOM XT15 Extractor、ANKOM Technology、米国ニューヨーク州マセドン）を用いて測定した。 |
| 2.5.3. 機能性発酵乳の粘度および官能評価 |
| 低温貯蔵中の試料の「見かけの粘度」は、ISO 7884-2 [32] の原理に基づいて測定した。測定には回転粘度計（NDJ-8S、Fangrui Instrument社製、中国・上海）を用い、スピンドル3を装着して、10℃、回転数60 rpmの条件で実施した。機能性発酵乳試料の官能特性（外観、テクスチャー、香り、味、および総合的な受容性）については、中国・西南大学食品科学学院の男性6名・女性4名からなる、十分な訓練を受けた10名のパネリストによって評価を行った。試料は発酵終了の24時間後に調製し、評価時まで4℃で保存した。各試料約30 mLを、ランダムなコードを付した同一の無色透明なカップに入れ、室温（20 ± 2℃）で提供した。各パネリストはランダムな順序ですべての試料を評価し、試料間には口内をリセットするための水を用意した。評価には9段階のヘドニック・スケールを用い、1を「極めて好ましくない」、5を「どちらでもない」、9を「極めて好ましい」とした [33]。 |
| 2.5.4. 乳酸菌の生存性 |
| 低温貯蔵中、乳酸菌数はMRS培地を用い、37℃、嫌気条件下で72時間培養して測定した [34]。 |
| 2.5.5. 生理活性化合物および抗酸化活性 |
| 機能性発酵乳サンプル20 gを精密に秤量した。このサンプルをn-ヘキサンと1:3（w/v）の比率で混合した[35]。次いで、その混合物を超音波水浴中で、温度を一定に保ちながら超音波処理（15分間、30℃）に供した。脱脂後の残渣から、メタノール-水溶液を用いてポリフェノールおよびその他の抗酸化化合物を抽出した。一部改変を加えつつ、80%メタノール水溶液（v/v）をサンプルに対して1:10（w/v）の比率で添加した[36]。抽出は、4℃で24時間、連続的に撹拌しながら行った。抽出終了後、混合物をまず遠心分離（10,000× g、15分間、4℃）にかけ、不溶性粒子を沈殿させた。その後、上清をろ過し、透明な粗抽出液を得た。 |
| 総フェノール含量（TPC）は、Folin–Ciocalteu法[37]を一部改変した方法を用いて分析した。具体的には、抽出液300 µLを、希釈したFolin–Ciocalteu試薬および炭酸ナトリウム溶液（7.5%）と反応させた。30分間静置した後、765 nmにおける吸光度を測定した。TPCは没食子酸の検量線（0.02～2.0 mg/mL）から算出し、mg GAE/gとして表した。 |
| 総フラボノイド含量（TFC）は、塩化アルミニウム比色法 [38] を用いて測定した。測定は、抽出液500 µLと蒸留水2 mLの混合液に対し、5% NaNO2溶液150 µLを順次加え、6分後に10% AlCl3溶液150 µLを添加して行った。AlCl3溶液の添加から6分後、4% NaOH溶液2 mLを加えた。その後、蒸留水を用いて全量を5 mLに調整した。発色反応のために15分間静置した後、510 nmにおける吸光度を測定した。ルチン（250～1000 µg/mL）を用いて検量線を作成し、TFCを算出して、試料100 gあたりのルチン相当量（mg RE/100 g）として表した。 |
| 2.5.5.1抗酸化活性 |
| 抽出物を10 mLの80%メタノールに溶解した。この濃度の溶液を用いて、DPPH法[39]により抗酸化活性を測定した。DPPHラジカル消去活性は以下の手順で測定した：メタノール抽出液300 µLを0.2 mM DPPHメタノール溶液2.7 mLと混合した。ボルテックスミキサーで十分に撹拌した後、混合液を室温・暗所で30分間静置した。その後、UV-Vis分光光度計（Thermo Electron Corporation、韓国・器興）を用い、メタノールをブランク（対照）として517 nmにおける吸光度を測定した。試料の消去活性は、アスコルビン酸の検量線（0～15 µg/mL）に基づいて定量し、試料100 gあたりのアスコルビン酸相当量（mg）として表した。 |
| 鉄還元抗酸化能は、文献[39]に従って測定した。具体的には、希釈した各抽出液1 mLに、リン酸緩衝液（0.1 M、pH 6.6）2.5 mLおよびフェリシアン化カリウム溶液（1% w/v）2.5 mLを混合した。この混合液を50℃で20分間インキュベートした後、トリクロロ酢酸溶液（10% w/v）2.5 mLを添加した。最後に、得られた混合液2.5 mLに、蒸留水2.5 mLおよび塩化鉄(III)溶液（0.1% w/v）0.5 mLを混合した。30分間静置した後、700 nmにおける吸光度を測定した。すべての測定は3連で行った。還元能は、標準的な式を用いて算出し、パーセント（%）で表した。 |
| 2.5.5.2.アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害 |
| 抽出物を、0.1%ジメチルスルホキシド（Shanghai Aladdin、中国・上海）を含む50 mMリン酸緩衝液2 mLに溶解した。このリン酸緩衝液は、酵素を阻害することなく、化合物にとって最適なpHを提供するものである[40,41]。 |
| 2.6. 統計解析 |
| データは、3反復の平均値±標準偏差として表した。ただし、官能評価試験については10反復を用いた。統計解析には一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。ANOVAにより有意差（p < 0.05）が認められた場合、サンプル群間の平均値を比較するためにダンカンの新多重範囲検定（Duncan's new multiple range test）を適用した。すべての統計解析は、IBM SPSS Statistics package 24.0（SPSS, Chicago, IL, USA）を用いて行った。図の作成にはGraphPad Prism（V9.5.0）を使用した。 |
| 3. 結果と考察 |
| 3.1. 乳酸菌株によるアセチルコリンエステラーゼ阻害作用 |
| 伝統的な乳製品から分離された95株の乳酸菌のうち、48株（50.5%）が桿菌（ラクトバチルス属など）に、47株（49.5%）が球菌に分類された（表S2およびS3）。アセチルコリンエステラーゼ阻害活性についてスクリーニングを行ったところ、桿菌の分離株のうち14株が高い阻害作用を示した（図1a、表S2）。球菌については、エンテロコッカス属の分離株であるEKA11の1株のみが高い阻害作用を示し（図1b、表S3）、その他の株は軽度から中程度の活性を示すにとどまった。図1aおよび1bは、すべての分離株について、代表的な単一実験における阻害率（%）の分布を示している。各分離株について3回の反復実験（n = 3）を行った際の平均値と標準偏差を含む完全なデータセットは、補足表S2およびS3に記載されている。分離株AY8が最も強力なアセチルコリンエステラーゼ阻害作用（46.99% ± 0.26）を示し、次いで桿菌株AY19（46.50% ± 1.46）、エンテロコッカス属株EKA11（46.19% ± 2.11）の順であった（表1）。これらの分離株の阻害活性は、標準薬であるドネペジル（0.1 mM）の阻害率（14.4% ± 0.05）を上回っていた（図1c）。また、その活性は0.1 mM濃度のガランタミン（39.96% ± 8.07）よりも高く、Qadahら[18]による先行研究で報告されたLevilactobacillus brevis P109の阻害率（9.85% ± 0.14%）を大幅に上回るものであった。先行研究によれば、コリン作動性神経伝達物質のレベルを高めることは、認知機能に好影響を及ぼし、アルツハイマー病の症状を緩和するとされている[42]。本酵素に対する従来の薬理学的阻害剤には、肝毒性や致死性のリスクが伴うことを踏まえると[43]、天然由来の阻害剤の開発は、革新的な治療および予防戦略となり得るものである。 |
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| 図1. 分離乳酸菌のアセチルコリンエステラーゼに対する阻害能。(a) 乳酸桿菌の阻害能 (b) 球菌の阻害能 (c) 乳酸菌およびエンテロコッカス属菌株によるアセチルコリンエステラーゼ阻害率（%）。GRS：ガランタミン標準品、DRS：ドネペジル標準品。 |
| 表1.0.3%胆汁酸塩、低pH（2.0および4.0）、および人工胃液中における、乳酸菌株のアセチルコリンエステラーゼ阻害率、抗菌活性、および生存率 |
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| ＊反復の平均値 ± 標準偏差。行内で同じ小文字、および列内で同じ大文字が付された平均値間には、有意差は認められなかった（p < 0.05）。 |
| 3.2. プロバイオティクスとしての潜在的特性 |
| 乳酸菌がプロバイオティクスとして有効に機能するためには、耐性などの特性が重要となります。プロバイオティクスとしての潜在的特性を評価した15株の乳酸菌分離株において、耐性に大きなばらつきが認められました。pH 2.0での培養後、分離株AY15およびAY16は極めて高い耐酸性を示しました。統計解析の結果、これらの条件下における生存率（47.66%～99.62%の範囲）の差は有意であることが確認されました（p < 0.05）。さらに、これらの分離株は腸内環境におけるストレス因子に対しても高い耐性を示しました。トリプシンを含む環境に曝露した際、生存率は46.66%から100%と極めて高い値を示しました。各菌株の生存率は、分離株ごとの固有の増殖特性を考慮し、最適条件下で培養した対照群（コントロール）に対する比率として算出されました。また、0.3%の胆汁酸塩存在下では、5つの分離株が60%を超える高い生存率を維持した一方、分離株AY8およびEMA9は中程度の耐性を示しました（表1）。すべての重要な試験において優れた安定した性能を示し、特に高い耐酸性、トリプシン存在下での高い生存率、そして強固な胆汁酸塩耐性を有することから、分離株AY15およびAY16が最も有望な候補として選定されました。神経系の健康や認知機能の調節において、主に「脳-腸軸」を介してプロバイオティクスが重要な役割を果たすことを示す証拠が、近年蓄積されつつあります [44,45]。 |
| プロバイオティクスは、いくつかの主要なメカニズムを通じて神経系に有益な効果をもたらします。具体的には、炎症性サイトカインの産生を抑制することで神経炎症を軽減し、血液-脳関門を強化するとともに、神経伝達物質のバランスを整える働きがあります。特に重要な機能の一つは、神経変性疾患の主要な要因である酸化ストレスに対抗する能力です。前臨床研究のデータによれば、プロバイオティクスは、アルツハイマー病モデルマウスにおいて認知機能を改善し、脳内でのアミロイドベータ・プラークの蓄積を抑制することが示されています[46]。こうした有益な効果はヒトにも及ぶものであり、臨床試験においても、プロバイオティクスの摂取がアルツハイマー病患者の認知機能を有意に改善し、神経認知機能の低下を遅らせるのに役立つことが実証されています[47]。 |
| 3.3. 抗菌活性 |
| 分離された乳酸菌が示す大腸菌（E. coli）およびSalmonella enterica serovar Typhimuriumに対する増殖抑制活性は、腸脳相関の観点から極めて重要です。これらの病原体は、神経炎症や神経変性を引き起こすメカニズムに関与しているためです[48]。中和処理を施した無細胞培養上清（CFS）は、試験対象の菌株に対して有意な抗菌活性を示しました（表1、図2）。大腸菌に対する阻止円の直径は11.25 ± 0.95 mmから18.66 ± 0.57 mmの範囲にあり、Salmonella entericaserovar Typhimuriumに対する直径は11.33 ± 0.57 mmから19.33 ± 1.52 mmの範囲でした[49]。大腸菌の一部の菌株はアミロイド・カーリー（curli）タンパク質を産生することが知られており、サルモネラ感染は全身性炎症の連鎖反応を引き起こす可能性があります[50]。これらはいずれも、パーキンソン病やアルツハイマー病の特徴であるα-シヌクレインやアミロイドβといった神経タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関連しています[51]。したがって、当該乳酸菌株は大腸菌やSalmonella enterica serovar Typhimuriumの増殖を効果的に抑制することで、腸内恒常性（ホメオスタシス）の維持に寄与します。この作用は、病原体に起因する腸内細菌叢の乱れ（ディスバイオシス）を防ぎ、炎症誘発性分子の負荷を軽減し、ひいては脳機能障害の主要な要因を緩和します。その結果、腸脳相関を介した神経保護効果に寄与する可能性があります[52]。 |
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| 図2. 選抜された分離株の (a) 大腸菌（Escherichia coli、10⁹ CFU/mL）および (b) サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium、10⁹ CFU/mL）に対する抗菌活性。C+：アンピシリン（10 mg/mL）、C-：培養培地。 |
| 3.4. グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）遺伝子の検出 |
| 選抜されたすべての乳酸菌およびエンテロコッカス属菌株においてPCRによりgad遺伝子が確認されたことは、それらが本来γ-アミノ酪酸（GABA）を産生する能力を有していることを裏付けています（図3）。この知見は、既に確認されているアセチルコリンエステラーゼ阻害活性と相まって、神経保護における相乗的な二重のメカニズムを示唆しています。アセチルコリンエステラーゼ阻害はコリン作動性シグナル伝達を増強して認知機能を支える一方で、それに伴うγ-アミノ酪酸産生は、神経疾患における重要な課題である興奮毒性に対処する役割を果たします[53]。 |
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| 図3. 供試菌株におけるgad遺伝子検出のための代表的なゲル電気泳動像。M：DNAマーカー（100–3000 bp）、C+：L. plantarum SWU-ZFT6 (GDMCC 66290)、C-：L. rhamnosusDSM 2002.1。 |
| アルツハイマー病の進行において、内因性γ-アミノ酪酸作動性系が病態を悪化させる役割を果たすと報告されている点については、その文脈を適切に理解する必要があります[54]。この機能障害は、γ-アミノ酪酸そのものの有害な作用というよりは、むしろγ-アミノ酪酸作動性の抑制的トーン（抑制機能）の喪失を反映している可能性が高いと考えられます。したがって、細菌由来のγ-アミノ酪酸は、低下した抑制機能を回復させ、グルタミン酸を介した興奮毒性に拮抗するとともに、神経細胞の健全性維持に不可欠な興奮・抑制のバランスを再調整する役割を果たす可能性があります[55]。このような多標的アプローチは、神経変性疾患の根本的な病態プロセスに働きかけるものであり、単なる対症療法にとどまらない有望な戦略と言えます。 |
| 3.5. 溶血活性および薬剤感受性試験（AST） |
| 調査対象として選定されたすべての乳酸菌分離株は、γ-溶血性表現型を示し、溶血性を示さないことが確認された。さらに、供試抗生物質に対する薬剤感受性試験（AST）の結果、分離株ごとに異なる耐性および感受性のパターンが認められた（表2）。具体的には、アンピシリン、セフトリアキソン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、およびシプロフロキサシンに対して高い感受性が観察された。対照的に、ゲンタマイシンおよびペニシリンに対しては一部の菌株で耐性が認められ、テトラサイクリンに対しては感受性から中等度耐性まで、菌株によって異なる反応が示された。特筆すべき点として、リンコマイシンおよびスルファメトキサゾールに対する耐性は比較的少なかったものの、一部の分離株では中等度耐性が認められた（表S4）。OhおよびJung [56] は、抗生物質耐性および溶血活性を示さないことが、安全な新規プロバイオティクス分離株を選定する際の基本要件であると報告している。 |
| 表2.16S rRNA遺伝子塩基配列解析による乳酸菌分離株の同定およびその安全性特性 |
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| 3.6. 分子生物学的同定 |
| 分離された乳酸菌の16S rRNA遺伝子を増幅・塩基配列決定し、菌株レベルでの同定を行った（表2）。分離株のうち、ヤク乳から分離されたものはすべてLactobacillus delbrueckiiに同定されたが、亜種レベルでは異なる菌株であった。 |
| 3.7. AY8およびAY15のゲノム特性 |
| AY8およびAY15は、プロバイオティクスとしての耐性試験において優れた性能を示し、かつ最も高いアセチルコリンエステラーゼ阻害能を有していたことから、全ゲノム解析および詳細なゲノム調査の対象として選定された。ゲノム解析の結果、両菌株はそれぞれ全長1,897,414 bpおよび1,890,519 bpの環状染色体を有することが明らかになった。両菌株の平均GC含量は約49.60%であった。AY8の染色体には1,913個のCDS、27個のrRNA、および95個のtRNAが含まれていた。一方、AY15には1,907個のCDS、24個のrRNA、および88個のtRNAが含まれていた（図4）。病原性解析の結果、臨床的に問題となる抗生物質耐性遺伝子、重要な病原性因子、および毒素関連遺伝子は検出されなかったことから、これらはプロバイオティクスサプリメントとして利用可能な候補であると考えられる[57]。 |
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| 図4. (a) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus AY8 および (b) Lactobacillus delbrueckii subsp. allosunkii AY15 の環状ゲノムマップ。 |
| 3.7.1. プロバイオティクス関連遺伝子の特定 |
| L. delbrueckii subsp. Bulgaricus AY8およびL. delbrueckii subsp. Allosunkii AY15のゲノムアノテーションに基づき、プロバイオティクスに関連するいくつかの遺伝子が特定された（表3）。ゲノム解析により、LPxTGモチーフタンパク質、ソルターゼA（srtA）、エノラーゼ（eno）など、細菌表面成分と宿主上皮細胞表面受容体との特異的な相互作用に不可欠な、付着およびバイオフィルム形成に関連する遺伝子の存在が明らかになった[58]。さらに、胆汁酸および酸に対する耐性を付与する遺伝子（cfa、nagB、ppa、nhaC、napA）が両菌株で一貫して検出された。これらの遺伝子の存在は、消化管内での菌の生存・定着を裏付けるものであり、宿主の特定の作用部位において相互作用や有益な効果を発揮するのに十分な生菌数で到達することを可能にしている[59]。ストレス適応機構も確認され、高温下で機能する一連の熱ショックタンパク質（htpX、hrcA、grpE、dnaK、dnaJ、groES、groEL）が揃っており、急激な熱ショックストレスに対する防御機構の存在が示された。加えて、両ゲノムには低温ストレス制御因子（cspA）も存在しており、これは至適増殖温度を下回る環境下での生存に寄与するものである[60]。さらに、クラスIIIランチオニン・バクテリオシンであるRamCの検出により、抗菌活性も確認された。RamCは熱安定性バクテリオシンであり、細菌細胞壁の加水分解を触媒して細胞の溶菌および死滅を引き起こすものである[61]。 |
| 表3. KEGGアノテーションに基づく、Lactobacillus delbrueckii株AY8およびAY15のゲノム配列におけるプロバイオティクス関連遺伝子の予測 |
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| ここで、(+)：存在、(-)：不在 |
| 3.7.2. アセチルコリンエステラーゼ阻害に関与する遺伝子の特定 |
| AY8およびAY15のゲノム配列には、アセチルコリンエステラーゼの阻害に直接的または間接的に関与し、神経変性疾患に対する保護作用をもたらす可能性のある遺伝子がいくつか特定されました。AY8およびAY15株では、神経活性分子の合成に関与する遺伝子、特にグルタミン酸からγ-アミノ酪酸への変換に関連するgadC遺伝子が見出されました。この遺伝子は、γ-アミノ酪酸の排出およびグルタミン酸の取り込みに関与しています[62]。グルタミン酸の脱炭酸反応によって生じる産物は、ヒトの中枢神経系において抑制性神経伝達物質として機能します[63]。さらに、pcp遺伝子にコードされるピログルタミルペプチダーゼは、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）を分解する、膜結合型の高い特異性を持つ酵素です[64]。甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンは脳内で恒常性維持に関わる多機能なトリペプチドとして作用し、神経細胞の興奮性に直接影響を及ぼすほか、気分のバランスにも関与している可能性があります[65]。加えて、リボフラビン合成関連遺伝子（ribE、ribD）の存在は、AY8がリボフラビン（ビタミンB2）を合成する能力を持つことを示唆しており、これらの遺伝子を欠くAY15と比較してAY8がin vitroで高いアセチルコリンエステラーゼ阻害能を示したことの理由となり得ます。実際、リボフラビンはミエリンの合成に不可欠であり、細胞のエネルギーバランスの維持や酸化ストレスの低減を通じて神経保護に寄与します[66]。さらにリボフラビンは、アルツハイマー病において機能低下が生じる抗酸化防御機構（グルタチオン還元酵素やカタラーゼなど）やミトコンドリアでのエネルギー産生をサポートします[67]。このようなゲノム上の差異は、プロバイオティクス株の神経活性特性の調節におけるリボフラビン産生の役割を実験的に検証しようとする今後の研究において、メカニズム解明に向けた有力な手がかりとなります。 |
| さらに、これら2つの菌株は、葉酸（ビタミンB9）の合成に不可欠なジヒドロ葉酸合成酵素をコードするfolC遺伝子を保有しています。先行研究では、十分な葉酸の摂取がアルツハイマー病の発症リスクを低減させる可能性が報告されています[68]。また、両菌株にチオレドキシン（Trx）が存在することも、神経保護作用というさらなる特性を示唆しています。チオレドキシンは細胞内の酸化還元恒常性の維持に寄与しており、神経変性疾患、神経炎症性疾患、および神経系の酸化ストレスに関連する広範な疾患の予防や治療において、有望な治療薬として認識されています[69]。加えて、両菌株は多種多様な細胞外多糖（EPS）産生に関与する遺伝子クラスターを保有しています。アルツハイマー病に対する乳酸菌の潜在的な保護作用についてはこれまでいくつかの研究が行われてきましたが、近年の研究では、そうした作用が、特に乳酸菌が産生する細胞外多糖に起因することが示されています。そのメカニズムとしては、ラジカル消去能、過酸化反応生成物の制御、アポトーシスへの関与などが挙げられます[1]。 |
| 発酵試験に用いるLactobacillus delbrueckii AY8およびAY15の最終選定は、表1に詳述されるそれらの相補的な機能特性の総合的な評価に基づいて行われました。AY8（L. delbrueckii subsp. bulgaricus）は、スクリーニングされたすべての分離株の中で最も高い生物活性を示す、優れたアセチルコリンエステラーゼ阻害活性（46.99 ± 0.26%）とγ-アミノ酪酸産生能を有することから、主要な神経保護株として選定されました。胆汁酸塩耐性は中程度（49.47%）でしたが、その卓越した神経保護特性が選定の根拠となりました。AY15（L. delbrueckii subsp. lactis）が、有力な候補であったAY16ではなく選定されたのは、神経保護能とプロバイオティクスとしての堅牢性（ロバストネス）のバランスの取れた組み合わせを戦略的に評価したためです。両株とも優れたストレス耐性を示しましたが、AY15は有意に高い汗エチルコリンエステラーゼ阻害活性（39.86% 対 37.08%）、Salmonella enterica serovar Typhimuriumに対する顕著な抗菌活性（阻止円径15.0 mm 対 AY16は0 mm）、および優れた胃酸耐性（pH 2.0において99.94% 対 97.29%）を示しました。さらに、ゲノム解析によりAY15にEPS（細胞外多糖）遺伝子クラスターが確認され、製品の食感形成における技術的特性の向上が予測されました。このような戦略的な組み合わせにより、AY8の標的とする神経保護効果とAY15の多機能なプロバイオティクスとしての堅牢性との間で最適な相乗効果が確保され、実証された健康上の利点を持つ高度な機能性発酵乳を開発するための理想的な基盤が構築されます。 |
| 3.8. 発酵乳に対する選定菌株およびナツメ種子粉末の影響 |
| 3.8.1. 理化学的特性 |
| ナツメ種子粉末（JP）を2%添加しても、対照と比較してpHに有意な変化は認められなかった（p > 0.05）。これは、ナツメ種子粉末に含まれるタンパク質が持つ緩衝能 [70] が、発酵中に通常生じるpH低下を緩和したためであると考えられる [71]。一方で、保存期間中にはすべてのサンプルで酸度の有意な上昇が認められ（p < 0.05）、乳酸菌の代謝活性が持続していたことが示された。この酸生成はナツメ種子粉末添加サンプルにおいてより顕著であり、同粉末に含まれるプレバイオティクス成分が細菌の活性および酸生成を促進したことが示唆された（図5）。栄養成分分析の結果、ナツメ種子粉末の添加により脂質含量のわずかな増加が確認された（表4）。これは、脱脂ナツメ種子粉末（残存脂質：5.1%）を使用したことと整合する結果である。この手法は、目的とする生理活性成分を濃縮しつつ、ワックスエステルの消化性に関する懸念を最小限に抑えられるという利点がある。さらに、ナツメ種子粉末の添加により、発酵乳のタンパク質含量が有意に増加することも確認された。 |
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| 図5. 冷蔵保存中における機能性発酵乳の酸度（%）およびpH：(a) ナツメ種子粉末無添加の機能性発酵乳の酸度（%）、(b) 2%ナツメ種子粉末添加発酵乳の酸度、(c) ナツメ種子粉末無添加の機能性発酵乳のpH、(d) 2% JP添加発酵乳のpH。C2：市販スターターを用いた対照発酵乳；T4：AY8を副次スターターとして用いた発酵乳；T5：AY15を副次スターターとして用いた発酵乳；T6：AY8とAY15の混合菌株を副次スターターとして用いた発酵乳；C1：2%ナツメ種子粉末を添加した市販スターター使用の対照発酵乳；T1：2% JPを添加し、AY8を副次スターターとして用いた発酵乳；T2：2% ナツメ種子粉末を添加し、AY15を副次スターターとして用いた発酵乳；T3：2% ナツメ種子粉末を添加し、AY8とAY15の混合菌株を副次スターターとして用いた発酵乳。 |
| 表4.機能性発酵乳の化学分析および官能評価 |
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| ＊反復の平均値 ± 標準偏差。行内で同じ小文字、または列内で同じ大文字が付された平均値間には、有意差は認められなかった（p < 0.05）。C2：市販スターターを用いた対照発酵乳；T4：AY8を補助スターターとして用いた発酵乳；T5：AY15を補助スターターとして用いた発酵乳；T6：AY8とAY15の混合菌株を補助スターターとして用いた発酵乳；C1：市販スターターを用い、ナツメ種子粉末を2%添加した対照発酵乳；T1：AY8を補助スターターとして用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T2：AY15を補助スターターとして用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T3：AY8とAY15の混合菌株を補助スターターとして用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳。 |
| 3.8.2. 粘度および官能評価 |
| 処理区間で粘度に有意差が認められた（p < 0.05）。図6aに示すように、エキソ多糖産生菌株AY15で発酵させ、かつナツメ種子粉末を添加したサンプルが最も高い粘度を示した。全ゲノム解析により、AY15のゲノムにはエキソ多糖生合成に不可欠な遺伝子クラスターが含まれていることが確認され（表3）、この遺伝的潜在能力が天然の増粘剤としての機能に直接結びついていることが示唆された[72]。ナツメ種子粉末の添加は単独でも粘度を上昇させたが、これはナツメ種子粉末に含まれる高含量のタンパク質（主にグルテリンおよびアルブミン）がゲルネットワークの形成に寄与するためであると考えられる[73]。サンプルT2で観察された最大粘度は、ナツメ種子粉末とAY15菌株との間に強力な相乗効果があることを示唆している。AY15の全ゲノム解析でエキソ多糖（EPS）生合成に必要な遺伝子群が完全に揃っていることが明らかになった点、およびナツメ種子粉末の繊維成分がプレバイオティクス基質として機能し得る点を踏まえると、エキソ多糖（産生の増大がレオロジー特性の改善に寄与している可能性があると推測される。しかし、このメカニズムを確実に裏付けるには、エキソ多糖（の直接的な定量測定が必要である。これは本研究の限界点であり、今後の研究における重要な課題である。 |
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| 図6. 冷蔵保存中における発酵乳の(a)粘度および(b)乳酸菌の生残性。C2：市販スターターを用いた対照発酵乳；T4：AY8を補助菌株として用いた発酵乳；T5：AY15を補助菌株として用いた発酵乳；T6：AY8とAY15の混合菌株を補助菌株として用いた発酵乳；C1：市販スターターを用い、ナツメ種子粉末を2%添加した対照発酵乳；T1：AY8を補助菌株として用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T2：AY15を補助菌株として用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T3：AY8とAY15の混合菌株を補助菌株として用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳。 |
| こうしたレオロジー特性の改善は、官能特性の向上に直接寄与しました。すべての機能性発酵乳サンプルにおける官能評価の平均スコアを、表4に示します。その結果、使用する菌株の選択とナツメ粉末の添加が、製品の官能特性に有意な影響を及ぼすことが明らかになりました。テクスチャーに関しては、AY15株を用いたサンプルが有意に高いスコア（p < 0.05）を示しました。その平均値は8.15 ± 0.63であり、対照区の6.2 ± 1.03を上回りました。これは、AY15株による菌体外多糖（EPS）の産生（in situ産生）が食感に好ましい影響を与えたことを裏付けるものであり、より濃厚で滑らかな口当たりをもたらしたと考えられます。 |
| ナツメ種子粉末の添加は、両菌株においてテクスチャーのスコアをさらに向上させ、機能的なテクスチャー改質剤としての役割を裏付ける結果となりました。対照的に、香気（アロマ）スコアの分析では、ナツメ種子粉末添加区を含むいずれの処理区間においても有意差（p > 0.05）は認められませんでした。すべての平均スコアは8.65～8.9という狭い範囲に収まっており、許容できるレベルでした。このことは、副次的なスターター（adjunct cultures）やナツメ種子粉末の添加によって、消費者に感知されるような異風味（オフフレーバー）が生じなかったことを示しており、消費者に受け入れられる製品とする上で極めて重要です。この知見は、ナツメ種子粉末が悪影響を及ぼすことなく発酵食品の香気特性を向上させ得ると報告したZhangら[74]の研究結果と一致しています。 |
| 味に関しては、好ましい有意な傾向が認められました。AY8とナツメ種子粉末を併用した処理区（T1）およびAY15とナツメ種子粉末を併用した処理区（T2）は、それぞれ8.2 ± 0.75および8.2 ± 0.48という最高の風味スコアを記録し、これらは対照区C2（7.3 ± 0.95）よりも有意に高い値（p < 0.05）でした。このことは、ナツメ種子粉末が特有の風味、ほのかな甘味、複雑味といった好ましい官能特性をもたらし、それによって風味に対する全体的な受容性が向上したことを示唆しています。これは、他の乳製品において植物性素材の添加による利点が確認されていることと整合しています[75]。 |
| さらに、処理区T1（AY8 + ナツメ種子粉末）およびT2も高い総合受容性（それぞれ8.4 ± 0.52および8.1 ± 0.74）を示し、統計的に有意差が認められなかった（p > 0.05）T3と共に、統計的に最上位のグループを形成しました。このことは、複数の配合、具体的にはAY8株またはAY15株とナツメ種子粉末を組み合わせたものが極めて良好な結果をもたらし、パネリストから対照区よりも好まれたことを示しています。これらの結果は、ナツメ種子粉末の添加が官能特性を向上させる重要な要因であり、ナツメ種子粉末と両細菌株との相乗効果によって、総合受容性に優れた製品が得られたことを裏付けています。 |
| 3.9. プレバイオティクスとしてのナツメ種子粉末の効果 |
| 図6bから、保存中に乳酸菌数が減少したことが観察された。しかし、対照サンプル（C2）を除くすべてのサンプルにおいて、菌数はプロバイオティクスとしての有効性に不可欠とされる10⁶ CFU/mL以上を維持していた[76]。本研究の最も重要な知見は、対照サンプルとナツメ種子粉末を添加したヨーグルトの間で、乳酸菌の生存率に著しい差が見られたことである。低タンパク質の牛乳をベースとした対照サンプルでは、乳酸菌数が4桁（4-log）も減少するという壊滅的な結果となり、栄養が限られた環境下での酸生成進行（post-acidification）に伴う過酷なストレスが浮き彫りとなった。対照的にナツメ種子粉末を添加したすべてのサンプルでは、細菌の生存率が著しく向上した。この有力な証拠は、ナツメ種子粉末がプレバイオティクスとしての栄養供給や抗酸化作用を通じて重要な保護効果をもたらしていることを示唆している。これにより、ナツメ種子粉末は単なる強化素材にとどまらず、ヨーグルトのプロバイオティクスとしての潜在能力を大幅に高める機能性安定化剤としての役割を担っていることが明らかになった。ナツメ種子粉末を添加したサンプルでは乳酸菌数の減少が有意ではなく（p > 0.05）、細菌の生存に対する顕著な保護効果が示された。ナツメ種子粉末存在下での乳酸菌の生存は、その独特な生化学的組成に直接起因すると考えられる。ナツメの種子は、多糖類や、フラボノイド、サポニンを含む様々な生理活性化合物の豊富な供給源である[77,78]。これらの成分は、主に2つのメカニズムを通じて作用していると考えられる。第一は多糖類によるプレバイオティクス効果であり、多糖類はプレバイオティクスとして機能し、乳酸菌の発酵基質となることが知られている[79]。第二は抗酸化作用による保護であり、強力な抗酸化特性を持つ生理活性化合物（フラボノイドなど）の存在によるものである[80]。保存中、乳酸菌は酸化ストレスにさらされ、細胞膜やDNAが損傷を受けて死滅に至る可能性がある。ナツメ粉末に含まれる抗酸化物質は、このストレスを緩和し、それによって細胞膜の完全性を維持し、細菌の生存率を高めると考えられる。乳酸菌数を10⁶ CFU/mL以上に維持することは極めて重要である。なぜなら、それは発酵製品の生化学的安定性を確保するだけでなく、腸内環境の健康に対するプロバイオティクスとしての潜在的な利点を保持することにもつながるからである。したがって、ナツメ種子粉末の配合は、プロバイオティクスを含む製品の保存期間および機能的品質を向上させるための、実現可能な天然由来の戦略となります。 |
| 3.10. 発酵乳の神経保護作用の可能性に関する評価 |
| 表5に示す結果から、試験したサンプル間で総フェノールおよびフラボノイド含有量に有意差（p < 0.05）があることが明らかになりました。機能性ナツメ発酵乳サンプルT1は、主要な生理活性成分および機能性活性において最も高い値を示しました。同サンプルは総フェノール（235.75 mg GAE/100 g）および総フラボノイド（114.07 mg RE/100 g）の濃度が最も高く、その優れた抗酸化能に寄与していました。この抗酸化能の高さは、DPPHラジカル消去活性（110.24 mg アスコルビン酸当量/100 g）およびFRAPアッセイ（99.07%）において最高値を示したことからも裏付けられています。さらに、ナツメ粉末を添加しない場合であっても、選抜された菌株（AY8およびAY15）で発酵させたサンプル（T4およびT5）では、対照（C2）と比較して生理活性の有意な向上が認められました。この活性の向上は、使用された菌株の代謝活性に直接起因すると考えられます。これらの菌株は、発酵過程において、複雑なフェノール化合物をより単純で生体利用能の高いフラボノイドへと生物変換したり、新たなフラボノイド分子を合成したりすることが知られています[81]。また、各菌株（AY8およびAY15）は、混合培養（T3およびT6）を行う場合よりも、単独で使用する場合の方がより高い効果を示すことが、結果から明らかになりました。 |
| 表5. 機能性ナツメ発酵乳の総フェノール量、フラボノイド含量、抗酸化活性、およびアセチルコリンエステラーゼ阻害活性 |
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| ＊反復の平均値 ± 標準偏差。行内で同じ小文字、または列内で同じ大文字が付された平均値間には、有意差は認められなかった（p < 0.05）。C2：市販スターターを用いた対照発酵乳；T4：AY8を補助スターターとして用いた発酵乳；T5：AY15を補助スターターとして用いた発酵乳；T6：AY8とAY15の混合菌株を補助スターターとして用いた発酵乳；C1：市販スターターを用い、JPを2%添加した対照発酵乳；T1：AY8を補助スターターとして用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T2：AY15を補助スターターとして用い、JPナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳；T3：AY8とAY15の混合菌株を補助スターターとして用い、ナツメ種子粉末を2%添加した発酵乳。 |
| 特筆すべきは、T1が30.66%という最も強力なアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示した点であり、これは神経保護作用の可能性において極めて重要な要素です。ナツメ粉末を含有していても特定の菌株による発酵を行っていないサンプルC1では、阻害率が18.27%と有意に低かったという事実は、生物活性の向上が主にその菌株の特異的な代謝活性に起因していることを裏付けています。このことは、サンプルT4およびT5においても強力なアセチルコリンエステラーゼ阻害（それぞれ24.49%および22.45%）が認められたことによっても裏付けられます。これらのサンプルは、フェノール類やフラボノイドの総含有量が低いにもかかわらず高い阻害率を示しており、菌株そのものが強力な阻害作用に寄与していることが確認されました。 |
| フラボノイドはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてよく知られていますが[82]、我々の結果は、選抜された菌株が単にこれらの化合物の量を増加させるだけではないことを示唆しています。むしろ、それらの菌株は基質を生物変換し、特定の強力な阻害剤を遊離または産生している可能性が高いと考えられます。そうした阻害剤には、特定のフラボノイド、生理活性ペプチド、γ-アミノ酪酸、あるいはその他の微生物代謝産物が含まれる可能性があります。T1製剤が優れた性能を示したことは、ナツメの基質（マトリックス）が、これら菌株特有の生物変換に最適な前駆体を提供することによる相乗効果を示唆しています。 |
| これらの知見は、特定の発酵菌株とナツメ種子粉末を組み合わせることで相乗効果を生み出し、食品の機能性、とりわけ神経保護作用を著しく高められる可能性を示唆しています。 |
| 本研究では、生理活性物質の産生およびアセチルコリンエステラーゼ阻害活性の向上において、2菌株を共培養する場合よりも、個々の菌株（特にAY8）を単独で用いた方が優れた性能を示すことが明らかになりました。混合培養において見られたこの明らかな拮抗作用は、微生物間の相互作用に関する重要な知見を提供するものであり、近年の科学的知見に基づき、いくつかのメカニズムの観点から説明可能です。観察された生理活性の低下は、資源をめぐる競合に起因している可能性があります。すなわち、同種に属する両菌株が、乳という環境下で同一かつ限られた栄養源を奪い合い、その結果、一方または双方の菌株における代謝活動が制限されたと考えられます[83]。さらに、環境変化を介した抑制作用も重要な役割を果たしている可能性があります。例えば、一方の菌株による急速な酸生成が、他方の菌株の増殖や酵素活性を阻害するような不適なpH環境を作り出していることが考えられます[84]。加えて、生理学的な負の相互作用が関与している可能性もあります。これは、一方の菌株が産生するバクテリオシンや有機酸などの代謝産物が、他方の菌株を直接的に阻害する現象です[85]。 |
| AY8は単独培養において優れた性能を示したことから、共培養系にAY15が存在することで、AY8における神経保護物質の産生に関与する特定の代謝経路が負に制御されている可能性が考えられます。この知見は、単に高性能な菌株を組み合わせるだけでは必ずしも相乗効果が得られるわけではなく、むしろ機能的な拮抗作用が生じる場合もあると指摘する近年の研究結果と整合するものです[86]。したがって、本研究の結果は、効果的な多菌株配合の機能性食品を設計する上で、菌株間の適合性や微生物の代謝的相互作用に関する詳細な理解が極めて重要であることを浮き彫りにしています。 |
| 4. 結論 |
| 本研究では、in vitroで顕著な神経保護能を示す新規プロバイオティクス株の単離に成功し、アセチルコリンエステラーゼ阻害作用とγ-アミノ酪酸産生能を実証しました。これらの株は、発酵乳製造における補助培養菌として適していることが証明されました。第一に、本研究は、γ-アミノ酪酸産生などの神経保護機能に対する遺伝的素因を持つ株を選抜するために、ゲノミクスに基づいたアプローチを採用することで、従来のプロバイオティクススクリーニングの枠を超えています。第二に、ナツメ種子粉末は単なる機能性成分ではなく、プロバイオティクスの生存率と最終製品の官能的受容性の両方を高める相乗効果のある成分であることを示し、機能性食品開発における一般的な課題を克服しました。最も重要なのは、本研究で開発した発酵乳が、標準薬であるドネペジルを上回るアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示すことをin vitroで実証した点です。これは、認知機能の健康に対する有望な天然由来の食事療法としての可能性を示しています。 |
| こうした有望な結果が得られた一方で、本研究にはいくつかの限界があることも認識しておく必要があります。主な限界は、神経保護作用がin vitro（試験管内）での試験に基づいている点です。今後は、in vivo（生体内）の動物モデル、さらには最終的にヒトを対象とした臨床試験において、本製品の有効性を検証する必要があります。さらに、ゲノム解析によって生理活性代謝産物の産生能が示唆されたものの、最終製品中におけるγ-アミノ酪酸の実際の含有量は測定されていません。最後に、製品の保存期間中におけるこれらの生理活性の長期安定性についても、未検証のままです。 |
| 結論として、本研究は、神経保護作用を持つ食品を開発するための有効な戦略として、特定のプロバイオティクス株や機能性植物成分を活用することの確固たる基盤を確立しました。今後の研究では、特定の生理活性代謝物の定量化、それらの正確な作用機序の解明、および生体内（in vivo）における治療的有効性の検証に重点が置かれる予定です。 |
参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
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この文献は、Foods. 2025 Dec 11;14(24):4264.に掲載されたDevelopment and Genomic Evaluation of a Novel Functional Fermented Milk Formulated with Lactobacillus delbrueckii Strains and Jujuba Kernel Powder for Potential Neuroprotective Effects.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |
